唐 亞， 廖日斌， 薛力瑋， 劉 穎

(桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院消化科， 廣西 桂林 541100)

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)在病程初期即可表現(xiàn)為胃腸功能紊亂，如麻痹性腸梗阻、腸道細(xì)菌的移位和腸道膿毒癥等，對(duì)SAP預(yù)后有重要影響[1-3]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的硫化氫(hydrogen sulphide，H2S)是體內(nèi)一種具有多種生物學(xué)活性的新型氣性分子[4-5]。腸道組織可表達(dá)H2S合成酶胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase，CSE)及胱硫醚-β-合成酶(cystathionine-β-synthase，CBS)，能合成內(nèi)源性H2S，H2S對(duì)腸道動(dòng)力具有抑制作用[6]。

目前H2S與SAP腸道動(dòng)力及炎癥的關(guān)系尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，有研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt/Sp1信號(hào)通路與CSE的表達(dá)調(diào)控存在一定聯(lián)系[7]。本研究運(yùn)用SAP大鼠模型，探討H2S對(duì)SAP腸道動(dòng)力及炎癥的影響及相關(guān)機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物及細(xì)胞

健康成年雄性Wistar大鼠由桂林醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物在室溫20～25 ℃、濕度(55±5)%環(huán)境下籠內(nèi)飼養(yǎng)，術(shù)前給予足夠飼料及飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案獲得桂林醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞(colonic muscle cells，CMCs)分離自距回盲部2 cm的近端結(jié)腸組織，用含0.15%膠原酶II、0.1%胰蛋白酶抑制劑以及0.25%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基37 ℃條件下常規(guī)培養(yǎng)。免疫熒光染色檢測(cè)α-actin對(duì)CMCs進(jìn)行鑒定。

2 主要試劑

抗CSE、CBS、磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylino 3 kinase，PI3K)、p-PI3K、蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)、p-Akt、Sp1以及GAPDH抗體均購(gòu)自Abcam。PI3K的抑制劑LY294002購(gòu)自Sigma。

3 主要方法

3.1SAP大鼠模型構(gòu)建 30只大鼠隨機(jī)分為3組，每組10只。假手術(shù)(sham)組僅進(jìn)行剖腹手術(shù)并對(duì)十二指腸和胰腺等部位進(jìn)行觸碰；SAP模型(SAP)組采用微量注射泵恒速注入新鮮溶于生理鹽水的5 %牛磺膽酸鈉進(jìn)胰膽管(1 mL/kg、0.1 mL/min)，持續(xù)10 min后縫合傷口；SAP+丙炔基甘氨酸(propargylglycine，PAG)組在注射牛磺膽酸鈉溶液后腹腔注射30 μmol/kg PAG(CSE抑制劑)。所有大鼠手術(shù)完成后立即皮下注射10 mL生理鹽水，并禁食24 h后處死大鼠。

3.2CMCs的處理 為了探討炎癥反應(yīng)對(duì)CSE的調(diào)控及相關(guān)機(jī)制，我們給體外培養(yǎng)的CMCs分別添加5%的SAP大鼠血漿、10 μg/L的TNF-α或10 μg/L的IL-6進(jìn)行處理。后續(xù)通過(guò)RT-qPCR及Western blot檢測(cè)細(xì)胞中CSE, CBS, Sp1 和 PI3K/Akt的表達(dá)。

3.3敲減CMCs內(nèi)Sp1基因的表達(dá) 特異性Sp1的siRNA序列(5’-GCAACAUGGGAAUUAUGAATT-3’)由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)，合成雙鏈后連接至pGL3穿梭載體。轉(zhuǎn)染過(guò)程使用試劑Lipofectamine 2000(Invitrogen)，并按照其操作說(shuō)明進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)分為4組，NC對(duì)照組：正常培養(yǎng)的CMCs；LY294002組：CMCs細(xì)胞加入5.0 μmol/L 的LY294002 孵育24 h；空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組：CMCs細(xì)胞轉(zhuǎn)染空的pGL3載體；Sp1干擾組：CMCs細(xì)胞轉(zhuǎn)染Sp1的siRNA。每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

3.4腸動(dòng)力評(píng)估 檢測(cè)術(shù)前1 h及術(shù)后4、14和24 h內(nèi)大鼠自然排便顆粒數(shù)以評(píng)估腸道動(dòng)力。

3.5炎癥因子檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)大鼠麻醉處死后并眼眶采集外周血，采用ELISA法檢測(cè)炎癥因子TNF-α 和 IL-6的濃度，具體操作方法參考試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

3.6免疫組織化學(xué)染色檢測(cè) 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)CSE和CBS表達(dá)，對(duì)距回盲部2 cm的近端結(jié)腸組織進(jìn)行固定包埋、切片、脫蠟并進(jìn)行抗原修復(fù)處理；滴加3%的H2O2溶液孵育15 min以封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；漂洗后加入 I 抗CSE (1∶200) 或CBS (1∶500),37 ℃孵育30 min后，4 ℃過(guò)夜；PBS漂洗后加入 II 抗，37 ℃孵育30 min；PBS漂洗后加入帶標(biāo)記抗生物素蛋白37 ℃孵育30 min，DAB染色3～10 min。玻片干燥后用蘇木精復(fù)染。Aperio ScanScope GL拍照。

3.7RT-qPCR實(shí)驗(yàn) 提取距回盲部2 cm的近端結(jié)腸組織或細(xì)胞的總RNA。β-actin為內(nèi)參照。采用BioTeke的Super M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒處理總RNA獲取cDNA模板，20 μL qPCR反應(yīng)體系包含10 μL的SYBR熒光染料及Taq II酶混合物，0.5 μL對(duì)應(yīng)引物(引物序列見(jiàn)表1)，1 μL cDNA模板以及8 μL去除RNA酶的H2O。擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)為：95 ℃10 min;95 ℃ 10 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。利用Data Assist Software version 3.0軟件，按照2-△△Ct的方法分析計(jì)算出目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 RT-qPCR的引物序列

F: forward; R: reverse.

3.8Western blot分析 采用Wanleibio總蛋白提取試劑盒提取提取距回盲部2 cm的近端結(jié)腸組織或細(xì)胞樣品。GAPDH為內(nèi)參照。BCA方法確定樣品蛋白濃度，取40 μg的蛋白進(jìn)行10%的SDS-PAGE。將條帶轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，TBST清洗膜5 min，然后用脫脂牛奶溶液封閉處理1 h。分別孵育 I 抗CSE(1∶500)、CBS(1∶1 000)、PI3K (1∶2 000)、p-PI3K(1∶1 000)、Akt(1∶2 000)、p-Akt(1∶1 000)、Sp1(1∶2 500)和GAPDH(1∶2 000)，4 ℃過(guò)夜。TBST振蕩漂洗4次，4 ℃孵育HRP標(biāo)準(zhǔn)的 IgG (1∶5 000) II 抗45 min。TBST漂洗6次，Beyo ECL Plus顯色條帶并用Gel Imaging System拍照。采用Gel-Pro-Analyzer分析條帶灰度值評(píng)估以上蛋白的表達(dá)水平。

3.9免疫熒光檢測(cè) 免疫熒光方法檢測(cè)敲減Sp1表達(dá)后CSE蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)分布。將細(xì)胞接種至24孔培養(yǎng)板，PBS漂洗后加入4%的多聚甲醛固定15 min；添加5% Triton X-100 處理30 min增加細(xì)胞膜通透性，PBS清洗3次，每次5 min；10%的山羊血清處理15 min；添加CSE的I 抗(1%的山羊血清稀釋：稀釋比例1∶50)，4 ℃孵育過(guò)夜；顯色時(shí)使用Alexa Fluor 594結(jié)合的 II 抗室溫孵育1 h；之后清洗細(xì)胞添加DAPI染料，室溫染色5 min；PBS緩沖液漂洗5次，每次5 min。待玻片干燥后采用熒光顯微鏡拍照。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)都是以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)的形式表示。組間數(shù)據(jù)的多重比較采用單因素方差分析。方差齊則采用Tukey檢驗(yàn)方法，方差不齊則采用Tamhane’s T2 檢驗(yàn)方法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用GraphPad Prism 6軟件制圖以及做統(tǒng)計(jì)分析處理。

結(jié) 果

1 H2S參與腸動(dòng)力減退的發(fā)生

SAP組大鼠造模后24 h內(nèi)的排便顆粒數(shù)顯著少于假手術(shù)組(P<0.05)，SAP+PAG組排便顆粒數(shù)較SAP組顯著增加(P<0.05)，見(jiàn)圖1，提示內(nèi)源性H2S生成與重癥急性胰腺炎大鼠的腸動(dòng)力減退相關(guān)。

Figure 1. The number of fecal pellets in the rats with different treatment at different time points. Mean±SD.n=10.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsSAP group.

圖1 各組大鼠不同時(shí)間排便顆粒數(shù)的比較

2 SAP誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)與內(nèi)源性H2S生成相關(guān)

ELISA結(jié)果顯示,SAP組血漿中TNF-α和IL-6的含量顯著增加(P<0.05)，使用PAG抑制H2S生成后可降低TNF-α和IL-6含量(P<0.05)，見(jiàn)圖2。免疫組化顯示SAP組結(jié)腸黏膜、黏膜下層和肌層均有CSE和CBS的分布,而SAP+PAG組CSE分布明顯減少，CBS分布無(wú)明顯變化；RT-qPCR結(jié)果顯示，SAP組的近端結(jié)腸CSE和CBS mRNA表達(dá)增加；SAP+PAG組的CSE mRNA表達(dá)較SAP組明顯降低(P<0.05)，而CBS mRNA表達(dá)較SAP組無(wú)明顯變化，見(jiàn)圖3。結(jié)果提示內(nèi)源性H2S與SAP誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)存在密切聯(lián)系。

Figure 2. The concentrations of inflammatory cytokines in the plasma of peripheral venous blood by ELISA. Mean±SD.n=10.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsSAP group.

圖2 外周血炎癥因子水平的比較

Figure 3. Production of H2S synthesizing enzymes were induced by SAP. A: the images of immunohistochemical staining (×200); B: the mRNA expression of CBS and CSE in colon of rats. Mean±SD.n=10.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsSAP group.

圖3 SAP誘導(dǎo)H2S合成酶的產(chǎn)生

3 PI3K/Akt/Sp1通路的激活

SAP組近端結(jié)腸CBS 和 CSE蛋白表達(dá)水平均高于假手術(shù)組，SAP+PAG組的CSE蛋白表達(dá)水平下調(diào)(P<0.05),見(jiàn)圖4A；SAP組與SAP+PAG組PI3K、Akt的磷酸化水平均明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)，Sp1表達(dá)上調(diào)(P<0.05)；而SAP組和SAP+PAG組比較PI3K和Akt磷酸化水平及Sp1的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性見(jiàn)圖4。

4 SAP激活炎癥反應(yīng)促進(jìn)內(nèi)源性H2S的生成

分離培養(yǎng)CMCs，使用DAPI標(biāo)記細(xì)胞核，使用α-actin對(duì)CMCs進(jìn)行鑒定，見(jiàn)圖5。分別使用SAP組大鼠的血漿，或TNF-α和IL-6處理培養(yǎng)的CMCs 24 h，發(fā)現(xiàn)均能顯著提高CBS 和 CSE的mRNA表達(dá)水平(P<0.05)，見(jiàn)圖6A；與對(duì)照組(細(xì)胞不做任何處理)相比，SAP組、TNF-α組和IL-6組PI3K/Akt/Sp1通路及CSE蛋白表達(dá)也是呈現(xiàn)被激活的狀態(tài)(P<0.05)，見(jiàn)圖6B、C。使用免疫熒光方法檢測(cè)CSE在CMCs中的表達(dá)分布，其結(jié)果與RT-qPCR結(jié)果一致，見(jiàn)圖7。上述結(jié)果提示SPA血漿及促炎癥因子TNF-α、IL-6可促進(jìn)腸道平滑肌細(xì)胞CBS和CSE的表達(dá)。

5 驗(yàn)證SAP激活PI3K/Akt/Sp1通路促進(jìn)內(nèi)源性H2S的生成

使用PI3K的特異性抑制劑LY294002以及Sp1的siRNA(si-Sp1)干預(yù)SAP血漿培養(yǎng)的CMCs 24 h后，PI3K、Akt蛋白磷酸化水平及Sp1蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.05)，CMCs的CSE蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，見(jiàn)圖8。CSE的免疫熒光檢測(cè)得到同樣結(jié)果，見(jiàn)圖9。提示SAP大鼠血漿處理的CMCs內(nèi)CSE表達(dá)增加與PI3K/Akt/Sp1通路的激活有關(guān)。

討 論

轉(zhuǎn)硫化通路是細(xì)胞內(nèi)提供半胱氨酸及合成氧化還原調(diào)控分子的一個(gè)重要的機(jī)制，其可以防止活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)引起的細(xì)胞損害[8]。在腫瘤及其它多類疾病發(fā)展進(jìn)程中轉(zhuǎn)硫化通路的缺失會(huì)引起促炎癥因子的過(guò)度生成，進(jìn)而導(dǎo)致慢性炎癥的發(fā)展[8]。內(nèi)源性H2S合成受CSE和CBE參與的轉(zhuǎn)硫化通路調(diào)控[9]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，H2S參與多種生理功能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，且H2S生成與炎癥反應(yīng)相關(guān)[10-11]。然而，H2S與炎癥反應(yīng)相互關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜，Wallace等[12]認(rèn)為H2S可以抑制TNF-α的生成及白細(xì)胞黏附在血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而保護(hù)胃腸功能；Tamizhselvi等[11]報(bào)道胰腺炎大鼠中H2S可誘發(fā)炎癥反應(yīng)。而H2S在SAP中與腸道的關(guān)系未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，本研究從炎癥及腸動(dòng)力減退探討H2S在SAP中的作用。

Figure 4. The protein levels of CSE, CBS (A) and PI3K/Akt/Sp1 (B) in colon of rats were determined by Western blot. Mean±SD.n=5.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsSAP group.

圖4 SAP時(shí)PI3K/Akt/Sp1信號(hào)通路激活

Figure 5. Separation，culture and identification of CMCs(×200).

圖5 CMCs的分離培養(yǎng)及鑒定

已明確H2S可抑制腸道動(dòng)力，本研究發(fā)現(xiàn)SAP大鼠結(jié)腸CSE和CBS的表達(dá)增加，提示內(nèi)源性H2S生成增加可能是SAP結(jié)腸動(dòng)力減退的機(jī)制之一。ATP敏感性鉀通道(ATP-sensitive potassium channels，KATP)是H2S主要的靶通道[13-14]，KATP通道開(kāi)放使膜電位超極化，電壓門(mén)控鈣離子通道關(guān)閉，通過(guò)降低胞內(nèi)Ca2+的濃度使得平滑肌松弛[15]。推測(cè)在SAP時(shí)H2S生成增加，通過(guò)促進(jìn)KATP通道開(kāi)放從而抑制結(jié)腸蠕動(dòng)。

本研究發(fā)現(xiàn)SAP組血漿中TNF-α和IL-6的濃度增加；使用CSE抑制劑PAG后H2S合成減少，血漿中TNF-α和IL-6的濃度顯著降低，提示H2S和炎癥因子之間可能存在相關(guān)性。使用SAP大鼠血漿及TNF-α和IL-6分別培養(yǎng)腸道平滑肌細(xì)胞，均發(fā)現(xiàn)CSE和CBS表達(dá)上調(diào)。以上結(jié)果提示在SAP時(shí)H2S可能為促炎因子，但導(dǎo)致H2S為促炎因子的始動(dòng)因素尚不清楚。

Figure 6. The expression of inflammatory cytokines and PI3K/Akt/Sp1 signaling pathway related molecules in the CMCs treated with 5% plasma from rats with SAP, TNF-α or IL-6. A: the relative mRNA expression of CSE, CBS and Sp1 was detected by RT-qPCR; B: the results of Western blot for determining the protein levels of PI3K, p-PI3K, Akt, p-Akt; C: the results of Western blot for determining the protein levels of Sp1 and CSE. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group.

圖6 SAP血漿、TNF-α和IL-6促進(jìn)腸道平滑肌細(xì)胞PI3k/Akt/Sp1信號(hào)通路激活及H2S生成

CSE和CBS是內(nèi)源性的H2S主要合成酶，而在結(jié)腸以CSE表達(dá)為主[6-7]。有研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt通路可以通過(guò)Sp1調(diào)控CSE的表達(dá)[7]，IL-6和TNF-α通過(guò)多種機(jī)制誘導(dǎo)PI3K/Akt通路的激活[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)SAP血漿中IL-6和TNF-α升高，同時(shí)PI3K/Akt通路被激活且進(jìn)一步上調(diào)了Sp1的表達(dá)，從而促進(jìn)了CSE蛋白的合成；采用PI3K的抑制劑LY294002可抑制Sp1活性及CSE合成。從而我們推測(cè)SAP時(shí)炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生增加激活了PI3K/Akt通路，通過(guò)上調(diào)Sp1的表達(dá)從而使內(nèi)源性H2S產(chǎn)生增加。

綜上所述，H2S可能參與SAP大鼠腸動(dòng)力減退的發(fā)病機(jī)制，并且可能作為促炎因子加速了SAP炎癥進(jìn)程，腸道內(nèi)源性H2S的生成受炎癥因子激活的PI3K/Akt/Sp1的信號(hào)通路影響。本研究初步表明H2S在SAP的發(fā)病機(jī)制中可能具有重要作用，為探討SAP腸功能紊亂的治療方法提供了新的線索。

Figure 7. The expression and distribution of CSE in the CMCs treated with SAP plasma, TNF-α or IL-6 (×200).

圖7 SAP血漿、TNF-α和IL-6促進(jìn)腸道平滑肌細(xì)胞CSE表達(dá)

Figure 8. The protein levels of PI3K, Akt (A), Sp1 and CSE (B) in the CMCs treated with LY294002 or si-Sp1. Mean±SD.n=5.*P<0.05vsSAP group;#P<0.05vsSAP+vector group.

圖8 Western blot檢測(cè)LY294002處理及轉(zhuǎn)染Sp1 siRNA后的CMCs內(nèi)PI3K/Akt/Sp1信號(hào)通路及CSE的蛋白水平變化

Figure 9. The expression and distribution of CSE in CMCs was limited by administration of PI3K inhibitor LY294002 (A) or Sp1 siRNA (B) as detected by immunofluorescence staining (×200).

圖9 免疫熒光方法檢測(cè)LY294002處理以及轉(zhuǎn)染Sp1 siRNA后CMCs內(nèi)CSE的表達(dá)和分布