王自闖， 陳小永， 張 娟

(河南中醫(yī)藥大學(xué)， 河南 鄭州 450002)

胰腺癌是一種較為常見的惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率逐漸升高。胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展受環(huán)境和遺傳因素的影響，與原癌基因的過度表達(dá)、細(xì)胞的無限增殖密切相關(guān)[1]。目前對該病的治療主要是通過手術(shù)和放化療等方法，但仍存在轉(zhuǎn)移率和復(fù)發(fā)率較高、預(yù)后較差等問題，仍需積極尋找有效的治療方法。

已有研究發(fā)現(xiàn)，蛋白酶體抑制劑依沙佐米(ixazomib)對惡性腫瘤有良好的療效，其主要作用機(jī)制是抑制26S蛋白酶體對蛋白質(zhì)的降解，促使細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)的蛋白代謝紊亂，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[2]。但關(guān)于依沙佐米對胰腺癌的作用尚不清楚。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展可通過激活一系列信號通路調(diào)控細(xì)胞的無限增殖和原癌基因的過度表達(dá)引起，NF-κB被激活后進(jìn)入核內(nèi)，參與多種基因的調(diào)控，參與腫瘤的生成、轉(zhuǎn)移和免疫等過程。研究發(fā)現(xiàn)NF-κB在胰腺癌細(xì)胞中表達(dá)升高，是抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子[3]。胰腺癌的發(fā)生發(fā)展與NF-κB信號通路激活相關(guān)，但關(guān)于依沙佐米對胰腺癌細(xì)胞的作用是否與NF-κB信號通路相關(guān)尚不清楚。本研究探討蛋白酶抑制劑依沙佐米通過調(diào)控NF-κB信號通路中的相關(guān)因子對胰腺癌細(xì)胞凋亡的影響。

材 料 和 方 法

1 材料與儀器

人胰腺癌細(xì)胞系CFPAC-1和PANC-1購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American Type Culture Collection，ATCC)。依沙佐米膠囊(德華中西藥房)；DMEM、RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco)；胰蛋白酶、MTT和DMSO(Amresco)；碘化丙啶(propidium iodide，PI；Sigma)；TRIzol試劑盒(Invitrogen)；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR PrimeScript RT-PCR試劑盒(TaKaRa)；BCA試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；PVDF微孔濾膜(Bio-Rad)；抗β-肌動蛋白(β-actin)、NF-κB p65、IκB激酶(IκB kinase，IKK)、caspase-3和Bax抗體(Proteintech)；標(biāo)記辣根過氧化物酶(HRP)的 II 抗(Pierce)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech)。ES-315高壓滅菌鍋(TOMY KOGYO)；伯樂680型多功能酶標(biāo)儀(Bio-Rad)；BD FACSCanto Ⅱ FACS流式細(xì)胞儀(BD)；BB15型CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermo)；E凝膠成像系統(tǒng)(UVP)；5430R離心機(jī)和Mastercycler eprealplex實(shí)時熒光定量PCR儀(Eppendorf)。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組 人胰腺癌細(xì)胞系CFPAC-1和PANC-1置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右時，棄掉培養(yǎng)基，適量PBS清洗，使用0.25% 的胰蛋白酶進(jìn)行消化，1 000 r/min離心收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109/L，接種到25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后開始分組，實(shí)驗(yàn)組按照蛋白酶體抑制劑依沙佐米濃度0、10、20、30和40 nmol/L加入培養(yǎng)體系培養(yǎng)12、18、24和48 h，每組設(shè)置3個平行對照。使用100% DMSO 溶解依沙佐米，調(diào)節(jié)其終濃度為0、10、20、30和40 nmol/L。

2.2RT-qPCR檢測細(xì)胞中mRNA的表達(dá) 收集用藥后各組細(xì)胞系對數(shù)期細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，熒光定量PCR儀進(jìn)行RT-qPCR檢測CFPAC-1細(xì)胞和PANC-1細(xì)胞中mRNA的相對表達(dá)量。SYBR Green法RT-qPCR反應(yīng)體系為25 μL：SYBR GreenⅡMaster Mix 12 μL，cDNA模板1 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 10 μL。參數(shù)設(shè)置為：95 ℃ 2 min; 95 ℃ 15 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s，共40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參照。采用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物公司合成，引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

2.3CCK-8法檢測細(xì)胞活力 收集對數(shù)期生長的各組細(xì)胞，調(diào)整濃度為4×108/L接種于96孔板中(每孔100 μL)，設(shè)置依沙佐米濃度為0、10、20、30和40 nmol/L的5組細(xì)胞分別培養(yǎng)12 h、18 h、24 h、48 h，每個濃度的每個時點(diǎn)設(shè)置3個重復(fù)，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每孔加入10 μL CCK-8溶液，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，使用酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光度(A)值。

2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 依沙佐米處理細(xì)胞24 h，0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化，室溫2 000 r/min離心5 min收集各組細(xì)胞；設(shè)置依沙佐米濃度為0、10、20、30和40 nmol/L 5組，每個濃度的設(shè)置3個重復(fù)，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞2次，調(diào)整細(xì)胞為2×109/L；吸取1 mL細(xì)胞懸液于離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗滌2次，沉淀中加入200 μL binding buffer混勻，上機(jī)前加入5 μL PI和5 μL膜聯(lián)蛋白V(annexin-V)，室溫避光反應(yīng)10 min，再加400 μL 緩沖液，1 h內(nèi)使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

2.5Western blot檢測各細(xì)胞中NF-κB p65、IKK、Bax和caspase-3的蛋白水平 取依沙佐米作用后的各組細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白法測定蛋白濃度，記錄562 nm處吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品濃度，SDS變性蛋白，Western blot檢測蛋白含量，取等量蛋白樣品(每孔50 μg)，SDS-PAGE分離，跑膠完轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，封閉1 h，稀釋 I 抗4 ℃孵育過夜，洗膜3次，每次5 min, II 抗孵育1 h，洗膜3次，每次5 min，ECL顯影液顯影，以β-actin為內(nèi)參照進(jìn)行灰度值比較。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采集的原始數(shù)據(jù)用SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組比較采用方差分析，各組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 依沙佐米對胰腺癌細(xì)胞活力的影響

CCK-8法檢測添加蛋白酶體抑制劑依沙佐米后胰腺癌PANC-1細(xì)胞和CFPAC-1細(xì)胞的活力，結(jié)果顯示添加10～40 nmol/L依沙佐米均對PANC-1細(xì)胞和CFPAC-1細(xì)胞的活力具有抑制作用，隨著濃度的增加抑制作用越來越顯著，濃度從20～30 nmol/L時抑制率變化最大(P<0.05)，在40 nmol/L時抑制效果最明顯。同一濃度隨著時間的延長抑制效果越來越明顯，在48 h抑制作用最強(qiáng)(P<0.05)，表明PANC-1細(xì)胞和CFPAC-1細(xì)胞的活力隨著依沙佐米濃度增加和作用時間延長越來越小，存在時間和劑量的依賴性，見圖1。

Figure 1. The effects of ixazomib on the viability of pancreatic cancer cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 nmol/L group;#P<0.05,##P<0.01vs12 h group.

圖1 依沙佐米對胰腺癌細(xì)胞活力的影響

2 依沙佐米對胰腺癌細(xì)胞系細(xì)胞凋亡的影響

對依沙佐米處理后24 h的各組細(xì)胞進(jìn)行凋亡率檢測，檢測結(jié)果顯示添加依沙佐米的PANC-1細(xì)胞和CFPAC-1細(xì)胞的凋亡率與0 nmol/L組比較均顯著升高(P<0.05)，10 nmol/L組與0 nmol/L組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，20和30 nmol/L組與10 nmol/L比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果表明隨著依沙佐米濃度的增加，各細(xì)胞系的凋亡率均顯著增加，10和20 nmol/L組比較凋亡率增高最顯著(P<0.05)，見圖2。

3 依沙佐米對胰腺癌細(xì)胞系中NF-κB p65、IKK、Bax和caspase-3 mRNA表達(dá)的影響

依沙佐米處理各組細(xì)胞24 h后，RT-qPCR檢測NF-κB通路相關(guān)因子NF-κB p65和IKK及凋亡相關(guān)因子Bax和caspase-3的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示添加依沙佐米后PANC-1細(xì)胞和CFPAC-1細(xì)胞中NF-κB p65和IKK的mRNA表達(dá)水平均顯著降低，且均與0 nmol/L組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；PANC-1細(xì)胞和CFPAC-1細(xì)胞中Bax和caspase-3的mRNA表達(dá)水平與0 nmol/L組比較均顯著升高(P<0.05)，見圖3。

Figure 2. The effects of ixazomib on the apoptosis of pancreatic cancer cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vs0 nmol/L group;#P<0.05vs10 nmol/L group;$P<0.05vs20 nmol/L group;&P<0.05vs30 nmol/L group.

圖2 依沙佐米對胰腺癌細(xì)胞凋亡的影響

4 依沙佐米對胰腺癌細(xì)胞中NF-κB p65、IKK、Bax和caspase-3蛋白表達(dá)水平的影響

進(jìn)一步采用Western blot檢測加入依沙佐米培養(yǎng)24 h后細(xì)胞中NF-κB通路相關(guān)分子NF-κB p65和IKK及凋亡相關(guān)因子Bax和caspase-3 的蛋白水平，檢測結(jié)果顯示添加依沙佐米后PANC-1細(xì)胞和CFPAC-1細(xì)胞中NF-κB p65和IKK的蛋白水平均顯著降低(P<0.05)，與mRNA檢測結(jié)果一致；CFPAC-1細(xì)胞中凋亡因子Bax和caspase-3的蛋白水平均顯著升高，PANC-1細(xì)胞的Bax蛋白水平顯著升高，caspase-3蛋白在10 nmol/L組增加不顯著，見圖4。2個細(xì)胞系均表現(xiàn)出隨著依沙佐米濃度的增加、凋亡因子逐漸增加的趨勢，表明蛋白酶抑制劑依沙佐米可以上調(diào)凋亡因子的表達(dá)。

Figure 3. The effects of ixazomib on the mRNA expression of NF-κB p65, IKK, Bax and caspase-3 in the pancreatic cancer cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vs0 nmol/L group;#P<0.05vs10 nmol/L group;$P<0.05vs20 nmol/L group;&P<0.05vs30 nmol/L group.

圖3 依沙佐米對胰腺癌細(xì)胞NF-κB p65、IKK、Bax和caspase-3 mRNA表達(dá)的影響

討 論

胰腺癌作為一種高度侵襲性的惡性腫瘤，往往因未能及時治療而延誤治療的最佳時機(jī)。胰腺癌細(xì)胞存在的內(nèi)源性或者獲得性耐藥機(jī)制使得其對多種治療藥物不敏感[4],因此需要探尋更為有效的治療胰腺癌的藥物。蛋白酶體抑制劑依沙佐米是一種可逆性的蛋白酶抑制劑，其在生理?xiàng)l件下可從檸檬酸鹽形式快速水解為具有活性的依沙佐米[5]。依沙佐米通過增加癌細(xì)胞對化療的敏感性對再復(fù)發(fā)病人的治療效果較為顯著[6]。研究報(bào)道，依沙佐米對移植瘤小鼠模型具有顯著的抗腫瘤效果[7]。故本研究通過多種現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)探究依沙佐米對胰腺癌細(xì)胞的作用。

研究報(bào)道胰腺癌動物模型中可見NF-κB處于激活表達(dá)，且多個胰腺癌細(xì)胞系中NF-κB均處于激活狀態(tài)[8]。IKK是NF-κB活化的上游激酶，靜止?fàn)顟B(tài)時與NF-κB結(jié)合在一起，但受到TNF-α和IL-1β刺激時，IKKβ亞基磷酸化與NF-κB解離，活化的NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄[9]。NF-κB激活后可對抗細(xì)胞發(fā)生凋亡，引起細(xì)胞無限增殖，促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲，導(dǎo)致細(xì)胞對凋亡的耐受及對藥物的耐藥[10]。依沙佐米在機(jī)體內(nèi)優(yōu)先結(jié)合20S蛋白酶體的β5亞基，抑制其胰凝乳蛋白酶樣活性，從而影響蛋白質(zhì)降解[11]。研究報(bào)道，依沙佐米通過靶向作用蛋白酶體，抑制相關(guān)蛋白如IκB，抑制NF-κB通路的激活，啟動凋亡程序，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[12]。依沙佐米可通過NF-κB抑制抗凋亡蛋白細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)周期蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞周期停滯在G2/M期，介導(dǎo)多種瘤細(xì)胞的凋亡[13]。抑制NF-κB信號通路在胃癌SGC-7901細(xì)胞中具有抗增殖作用[14]。因此抑制NF-κB的活化，下調(diào)胰腺癌細(xì)胞中NF-κB的表達(dá)，可以有效抑制細(xì)胞的活力。研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB抑制劑PTDC對骨癌小鼠細(xì)胞具有抑制作用，且可減輕其機(jī)械頭痛[15]。NF-κB抑制劑sulfasalazine 可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖[16]。Moreau等[17]報(bào)道，蛋白酶體抑制劑依沙佐米可以可有效治療多發(fā)性骨髓瘤，抑制細(xì)胞的增殖。本研究結(jié)果顯示添加依沙佐米后PANC-1細(xì)胞和CFPAC-1細(xì)胞的NF-κB p65和IKK的表達(dá)水平均顯著降低，表明依沙佐米抑制NF-κB通路的激活，提示依沙佐米可能是通過抑制NF-κB通路的活化影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。

Figure 4. The effects of ixazomib on the protein levels of NF-κB p65, IKK, Bax and caspase-3 in the pancreatic cancer cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vs0 nmol/L group;#P<0.05vs10 nmol/L group;$P<0.05vs20 nmol group;&P<0.05vs30 nmol group.

圖4 依沙佐米對胰腺癌細(xì)胞NF-κB p65、IKK、Bax和caspase-3蛋白水平的影響

本研究進(jìn)一步通過CCK-8法及流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)依沙佐米對人胰腺癌細(xì)胞PANC-1細(xì)胞和CFPAC-1細(xì)胞的活力具有一定的抑制作用及促凋亡作用，依沙佐米濃度的增加對胰腺癌細(xì)胞活力抑制作用更加明顯，誘導(dǎo)凋亡作用也越來越顯著。細(xì)胞凋亡過程中，Bcl蛋白家族中Bcl-2可抑制細(xì)胞的凋亡，Bax可對抑制凋亡蛋白Bcl-2產(chǎn)生抑制作用，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18]。夏永華等[19]報(bào)道，抑制NF-κB表達(dá)后，皮膚癌細(xì)胞中Bax凋亡蛋白表達(dá)顯著升高，并提高caspase蛋白的活性，促進(jìn)SCL-1細(xì)胞凋亡率明顯升高。caspase家族介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，是凋亡信號關(guān)鍵的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。caspase-3蛋白在NF-κB誘導(dǎo)的信號通路中具有終末效應(yīng)酶的作用，其可被caspase-8和caspase-9激活，caspase-3激活后裂解PARP和D4-GDI蛋白，引起細(xì)胞凋亡[20]。研究結(jié)果顯示，凋亡蛋白Bax和caspase-3在添加依沙佐米后其表達(dá)顯著增加，且一定范圍內(nèi)隨著抑制劑濃度的增加Bax、caspase-3 mRNA及蛋白水平逐漸升高，表明其受依沙佐米的調(diào)控，且表達(dá)存在濃度的依賴性。以上檢測結(jié)果表明依沙佐米對胰腺癌細(xì)胞的作用主要是通過抑制NF-κB通路的激活調(diào)控凋亡因子的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，蛋白酶體抑制劑依沙佐米抑制胰腺癌細(xì)胞的活力，促進(jìn)其凋亡，其可能是通過抑制NF-κB信號通路的激活調(diào)控凋亡蛋白的表達(dá)。目前尚需進(jìn)一步證明依沙佐米對NF-κB信號通路的調(diào)控作用，探究依沙佐米是通過直接還是間接作用來調(diào)控NF-κB信號通路發(fā)揮作用。