馬 翠， 白天鴿， 陳雅琳， 魏 虹

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室， 新疆 石河子 832002)

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一類(lèi)骨髓造血系統(tǒng)惡性克隆性疾病，中國(guó)發(fā)病率占所有白血病類(lèi)型的60%以上，且在持續(xù)上升。近年來(lái)有關(guān)報(bào)道指出AML發(fā)病年齡在65歲以上的患者越來(lái)越多，由于身體狀況的變化，患者的化療耐受又進(jìn)一步限制了治療效果[1]。自噬是細(xì)胞對(duì)外界變化的一種適應(yīng)機(jī)制，細(xì)胞在正常情況下也能產(chǎn)生自噬，維持胞內(nèi)物質(zhì)的更新。同時(shí)自噬也能導(dǎo)致細(xì)胞死亡，這是一種有別于凋亡的Ⅱ型程序性死亡方式[2-3]。研究表明姜黃素(curcumin，CUR)能誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[4-5]，且能產(chǎn)生自噬[6-7]并逆轉(zhuǎn)多藥耐藥[8-9]，調(diào)節(jié)腫瘤多藥耐藥基因的表達(dá)，促進(jìn)白血病病人對(duì)阿糖胞苷的敏感性[10]。姜黃素因其具有這些作用和優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)在聯(lián)合化療方面受到極大重視。相關(guān)報(bào)道顯示，姜黃素能誘導(dǎo)KG1a細(xì)胞凋亡[11]，但其對(duì)KG1a細(xì)胞自噬誘導(dǎo)的報(bào)道目前較少。在此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討姜黃素誘導(dǎo)KG1a細(xì)胞自噬的相關(guān)現(xiàn)象，及阿糖胞苷(cytarabine,Ara-C)對(duì)姜黃素誘導(dǎo)的KG1a細(xì)胞自噬的影響及其可能機(jī)制，為臨床用藥提供新思路。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞系及主要試劑

人急性髓系白血病細(xì)胞株KG1a購(gòu)自廣州賽庫(kù)生物技術(shù)有限公司。RPMI-1640培養(yǎng)基(GIBCO)；胎牛血清(四季青公司)；2.5%的戊二醛固定液、吖啶橙(acridine orange, AO)、姜黃素和阿糖胞苷(Sigma)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Perfect ReaL Time)(TaKaRa)。姜黃素和阿糖胞苷分別用DMSO與PBS配制成儲(chǔ)存液于-20℃冰箱中保存，使用時(shí)RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋到相應(yīng)終濃度。

2 主要方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) KG1a細(xì)胞用含10%胎牛血清的 RPMI-1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中加1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d更換1次培養(yǎng)液，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于96孔板，每孔180 μL體系中，調(diào)整細(xì)胞在每孔5×105個(gè)，5% CO2、37 ℃孵育培養(yǎng)過(guò)夜。不同濃度的姜黃素處理細(xì)胞24 h后，每組設(shè)立4個(gè)復(fù)孔，每孔終體積為200 μL，5% CO2、37 ℃孵育。在同一時(shí)點(diǎn)取出實(shí)驗(yàn)板加20 μL的5 g/L MTT溶液避光在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h后終止培養(yǎng)，去上清。每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，490 nm檢測(cè)各孔的吸光度(A)值。計(jì)算各組細(xì)胞活力抑制率(inhibition rate，IR)，IR(%)=[(A值陰性對(duì)照組-A值空白對(duì)照組)-(A值實(shí)驗(yàn)組-A值空白對(duì)照組)]/(A值陰性對(duì)照組-A值空白對(duì)照組)×100%。

2.3透射電鏡觀察 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞按5×106個(gè)接種于培養(yǎng)皿中，藥物處理24 h后收集細(xì)胞，用PBS洗2遍(1 000 r/min，2～3 min)，棄去上清。300 μL純血清重懸細(xì)胞后離心，吸凈上清。再500 μL電鏡專(zhuān)用2.5%的戊二醛固定液固定，緩慢加進(jìn)細(xì)胞沉淀并避免其被吹散。按照電鏡實(shí)驗(yàn)步驟的詳細(xì)說(shuō)明進(jìn)行后續(xù)操作并拍照分析。

2.4吖啶橙染色 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以1×109/L接種至24孔板，藥物處理后置于37 ℃、5% CO2濃度及飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)，孵育后在6、12和24 h分別取出細(xì)胞用PBS洗滌，加入終濃度為1 mg/L的吖啶橙染液，避光染色20 min后，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.5RT-qPCR實(shí)驗(yàn) 提取各組細(xì)胞總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit操作說(shuō)明書(shū)獲得cDNA。PCR反應(yīng)體系：10.0 μL SYBR SeLect Master Mix (2×)，2.0 μL cDNA template，上、下游引物各0.8 μL，加水至總體積為20.0 μL。PCR條件：95 ℃ 1 min;95 ℃ 10 s、60 ℃ 34 s，35個(gè)循環(huán)；60 ℃ 1 min。各種引物詳見(jiàn)表1，以2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

2.6Western blot實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的KG1a細(xì)胞，各組細(xì)胞同時(shí)在37 ℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)24 h后。利用RAPI裂解液提取總蛋白，每個(gè)泳道上蛋白樣品30 μg，經(jīng)10% SDS-PAGE分離后，利用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5% BSA的PBST溫箱中封閉1 h，洗滌1次后分別加入對(duì)應(yīng)I 抗(抗β-actin鼠單抗、LC3A/B兔單抗和beclin-1兔單抗，均1 ∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜，PBST洗滌3次，每次10 min；加入山羊抗兔IgG抗體孵育1 h。在膜上加入顯影液，曝光拍照。

表1 RT-q PCR引物序列

F: forward; R: reverse.

表2 不同濃度的姜黃素對(duì)細(xì)胞周期分布的影響

*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group.

2.7姜黃素對(duì)人急性髓系白血病KG1a細(xì)胞周期的影響 收集處于對(duì)數(shù)期的細(xì)胞，離心計(jì)數(shù)，以1×109/L接種到24孔板中，體系為每孔2 mL的細(xì)胞懸液，培養(yǎng)箱中觀察24 h后，以不同實(shí)驗(yàn)組處理(不同的藥物及濃度)，每個(gè)時(shí)點(diǎn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)立實(shí)驗(yàn)對(duì)照組(不加藥物的相同體積的PBS)。37 ℃、5% CO2濃度，飽和濕度培養(yǎng)箱中連續(xù)孵育24 h后。1.5 mL離心管收集細(xì)胞，預(yù)冷PBSF(加1%血清的PBS)500 μL洗滌2次，注意小心吸棄上清液。預(yù)冷70%乙醇500 μL冰上固定30 min后，預(yù)冷PBSF洗滌2次。 300 μL PBS重懸細(xì)胞加2 μL PI避光染色15 min后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的變化。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩組間數(shù)據(jù)對(duì)比采用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果

隨著藥物濃度的增加，姜黃素對(duì)KG1a細(xì)胞的活力抑制作用明顯增強(qiáng)(P<0.01)，即姜黃素對(duì)KG1a細(xì)胞活力的抑制作用有一定劑量依賴(lài)性，其中40 μmol/L的姜黃素24 h抑制率已經(jīng)達(dá)到(21.17±2.27)%，0.5 μmol/L的阿糖胞苷是(33.80±1.00)%。姜黃素(40 μmol/L)與阿糖胞苷(0.5 μmol/L)聯(lián)用處理KG1a細(xì)胞24 h后，聯(lián)合組的抑制率明顯高于單藥組(P<0.01)，且兩組均高于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

2 透射電鏡觀察KG1a細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化

電子顯微鏡下觀察KG1a細(xì)胞，處理24 h后，正常對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和線粒體等細(xì)胞器清晰可見(jiàn)，圖2A；姜黃素處理組可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)自噬小體(圖2B紅色箭頭所示)的出現(xiàn)；阿糖胞苷組雖然沒(méi)有明顯的自噬小體，但是有變形的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)即自噬小體前期結(jié)構(gòu)(圖2C紅色箭頭所示)；兩藥聯(lián)合組自噬小體的數(shù)量在增多，而且有時(shí)可見(jiàn)雙層膜包裹的自噬小體中含有蛋白或細(xì)胞器等待降解物質(zhì)，或者構(gòu)成的自噬小體中有溶酶體即自噬溶酶體的出現(xiàn)(圖2D紅色箭頭所示，結(jié)構(gòu)內(nèi)藍(lán)色箭頭所指為溶酶體)，且在聯(lián)合藥物組中細(xì)胞顯示晚期凋亡現(xiàn)象，凋亡小體形成，細(xì)胞核裂解，胞膜不完整。

3 AO染色結(jié)果

AO染色結(jié)果顯示，細(xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)酸性囊泡，在藥物作用6、12和24 h后，細(xì)胞中橙紅色的熒光量明顯增強(qiáng)，說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)酸性小泡數(shù)增多并且含有酸性小泡的細(xì)胞數(shù)均在增加。細(xì)胞形態(tài)也發(fā)生了改變。但在聯(lián)合組的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，細(xì)胞數(shù)量也在減少，在此條件下細(xì)胞主要是被誘導(dǎo)凋亡或死亡，見(jiàn)圖3。

Figure 1. The effects of curcumin (CUR) and cytarabine (Ara-C) on the viability of KG1a cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsCUR (20 μmol/L) group;#P<0.05,##P<0.01vsCUR (40 μmol/L) group;△△P<0.01vsAra-C (0.02 μmol/L) group;▲P<0.05vsAra-C (0.1 μmol/L) group;$$P<0.01vsAra-C (0.5 μmol/L) group.

圖1 姜黃素和阿糖胞苷對(duì)KG1a細(xì)胞活力的影響

4 姜黃素對(duì)KG1a細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同劑量的姜黃素作用細(xì)胞24 h后，KG1a細(xì)胞主要都被阻滯在G0/G1期， 40 μmol/L的姜黃素使KG1a細(xì)胞在G0/G1期的比例是(52.095±1.255)%(P<0.01)。并且各濃度組的姜黃素阻滯KG1a細(xì)胞在G0/G1期的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，說(shuō)明姜黃素主要是把細(xì)胞阻滯在G0/G1期，而與姜黃素的劑量無(wú)關(guān)。

Figure 2. The images of intracellular ultrastructural changes.A: control group; B: curcumin (CUR) alone group (40 μmol/L); C: Ara-C alone group (0.5 μmol/L); D: combination group (40 μmol/L of CUR and 0.5 μmol/L of Ara-C).

圖2 細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)的變化

Figure 3. Intracellular changes of the autophagy in the KG1a cells observed by acridine orange staining (×400).

圖3 吖啶橙染色觀察KG1a細(xì)胞內(nèi)自噬現(xiàn)象

5 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果

姜黃素單獨(dú)或聯(lián)合Ara-C處理KG1a細(xì)胞24 h后，與單一藥物組相比，聯(lián)合藥物組beclin-1的mRNA相對(duì)表達(dá)水平升高(P<0.01)，且均明顯高于對(duì)照組(P<0.01)。姜黃素組和聯(lián)合組LC3的mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組顯著升高(P<0.01)，且聯(lián)合組LC3的mRNA表達(dá)水平明顯高于單藥物組(P<0.01)，但阿糖胞苷組與對(duì)照組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖4。

6 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Western blot結(jié)果顯示，以0.5 μmol/L阿糖胞苷、40 μmol/L姜黃素和兩藥聯(lián)合分別處理KG1a細(xì)胞24 h后，聯(lián)合組的自噬標(biāo)志蛋白beclin-1的水平高于每一個(gè)單藥組(P<0.01)，且均高于對(duì)照組(P<0.01)。LC3-I向LC3-II轉(zhuǎn)化增多(P<0.01)，但阿糖胞苷組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖5。上述結(jié)果說(shuō)明聯(lián)合藥物處理組出現(xiàn)了明顯的自噬反應(yīng)。

Figure 4. The mRNA expression levels of beclin-1 and LC3 in the KG1a cells.Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vscombination group.

圖4 Beclin-1和LC3的mRNA表達(dá)變化

討 論

急性髓系白血病是我國(guó)常見(jiàn)惡性腫瘤之一。

Figure 5. The effect of curcumin (CUR) and/or Ara-C on the protein expression of beclin-1 and LC-3 in the KG1a cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vscombination group.

圖5 姜黃素和/或阿糖胞苷對(duì)細(xì)胞beclin1和LC-3蛋白表達(dá)的影響

AML的治療是以最大程度耐受性的誘導(dǎo)和緩解后治療為基礎(chǔ)，目前AML的誘導(dǎo)緩解治療仍是以蒽環(huán)類(lèi)抗生素聯(lián)合Ara-C組成的“3+7”方案為主。雖然阿糖胞苷可以有效殺死白血病細(xì)胞，但仍有較大副作用及許多耐藥機(jī)制導(dǎo)致部分患者無(wú)效。自噬被認(rèn)為是一種腫瘤抑制機(jī)制，細(xì)胞自噬是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，在生長(zhǎng)因子和DNA損傷等條件下均可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生并影響自噬水平的變化。細(xì)胞發(fā)生自噬時(shí)，一方面自噬使細(xì)胞免受惡劣環(huán)境的傷害，另一方面是一種有別于凋亡的Ⅱ型程序性死亡或自噬性死亡[12-14]。腫瘤細(xì)胞由于其發(fā)生發(fā)展的復(fù)雜多樣性導(dǎo)致了腫瘤治療的多樣化，隨著自噬的出現(xiàn)，人們?cè)诳鼓[瘤治療方面又有了新的理解和多一條對(duì)抗腫瘤的途徑，通過(guò)誘導(dǎo)自噬的發(fā)生達(dá)到有效的抗腫瘤效果。隨著聯(lián)合用藥的出現(xiàn)，新的抗腫瘤機(jī)制中減少了很多單一藥物的毒副作用即不良影響，而且聯(lián)合用藥不僅能增加藥物作用優(yōu)勢(shì)而且能增大療效。近年來(lái)對(duì)姜黃素的不斷研究發(fā)現(xiàn)姜黃素能誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生自噬。已知化療藥物對(duì)抗腫瘤目前研究最多的就是其促凋亡作用。但在本實(shí)驗(yàn)中研究發(fā)現(xiàn)姜黃素既能誘導(dǎo)KG1a細(xì)胞發(fā)生自噬，又能與化療藥物阿糖胞苷的聯(lián)合提高自噬的產(chǎn)生率，說(shuō)明兩藥的聯(lián)合提高了姜黃素誘導(dǎo)自噬的能力，從而增加了細(xì)胞因過(guò)度自噬產(chǎn)生的凋亡率。

研究表明姜黃素通過(guò)誘導(dǎo)自噬促進(jìn)白血病K562細(xì)胞死亡[15]，通過(guò)調(diào)控自噬誘導(dǎo)HPV陽(yáng)性宮頸癌SiHa細(xì)胞自噬性死亡[16]。阿糖胞苷是國(guó)際公認(rèn)抗白血病化療藥物之一，一直以來(lái)阿糖胞苷在與其它化療藥物聯(lián)用時(shí)也表現(xiàn)出了不錯(cuò)的療效，目前關(guān)于姜黃素聯(lián)合阿糖胞苷促進(jìn)急性髓系白血病KG1a細(xì)胞自噬的相關(guān)文獻(xiàn)還未見(jiàn)報(bào)道。本研究前期研究表明，姜黃素和阿糖胞苷兩藥具有協(xié)同抗腫瘤細(xì)胞的作用，對(duì)兩藥協(xié)同促進(jìn)KG1a細(xì)胞自噬做進(jìn)一步的探討，透射電鏡結(jié)果顯示，聯(lián)用組KG1a細(xì)胞的自噬小體數(shù)量遠(yuǎn)多于單用組，且均高于對(duì)照組。吖啶橙染色檢測(cè)結(jié)果也表明聯(lián)合作用高于單藥組。同時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明，聯(lián)用組的LC3和beclin-1的mRNA表達(dá)水平明顯高于單藥組，且顯著高于對(duì)照組。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果與mRNA表達(dá)水平變化一致。LC3蛋白在自噬形成時(shí)被加工成LC3-I，LC3-I會(huì)跟磷脂酰乙醇胺結(jié)合轉(zhuǎn)變?yōu)槟Ｐ蚅C3-II定位與自噬體膜上，直接參與自噬過(guò)程。LC3-II某種程度上反映了自噬體的數(shù)量，通常使用LC3-II與LC3-I蛋白表達(dá)量的比值作為自噬的特異性指標(biāo)，而自噬相關(guān)基因beclin-1基因也叫BECN1基因[17]，與酵母ATG6是同系物，是調(diào)節(jié)自噬過(guò)程的關(guān)鍵基因，姜黃素可通過(guò)上調(diào)beclin-1誘導(dǎo)人胃癌SGC7901細(xì)胞[18]和HPV陽(yáng)性宮頸癌SiHa細(xì)胞[16]等細(xì)胞自噬。同時(shí)姜黃素也能通過(guò)提高beclin-1等自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)增強(qiáng)細(xì)胞自噬作用[18]，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之相似。

綜上所述，姜黃素能誘導(dǎo)KG1a細(xì)胞自噬，且阿糖胞苷能明顯提高姜黃素的誘導(dǎo)細(xì)胞的自噬效應(yīng)，其可能是通過(guò)上調(diào)beclin-1、LC3的表達(dá)有關(guān)。但是阿糖胞苷聯(lián)合姜黃素對(duì)細(xì)胞的具體作用機(jī)制及自噬在殺傷腫瘤細(xì)胞中所扮演的角色尚不清楚，還需更深入的研究。

致謝：對(duì)石河子大學(xué)新疆高發(fā)病及多發(fā)病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的全體老師及同學(xué)表示感謝！