肖 猛, 任傳忠

(信陽職業(yè)技術學院醫(yī)學院， 河南 信陽 464000)

同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)又稱高半胱氨酸，是體內(nèi)氨基酸代謝后生成的代謝中產(chǎn)物，也是蛋氨酸循環(huán)的重要環(huán)節(jié)[1]。各種原因所致的血漿同型半胱氨酸水平升高均可形成高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia，HHcy)。近十年來，已有大量的臨床研究及流行病學調(diào)查研究顯示HHcy與心腦血管疾病、神經(jīng)性疾病以及糖尿病等的發(fā)病具有相關性[1-3]。特別是HHcy已成為心腦血管事件發(fā)生的獨立風險因素[4]，但HHcy致血管病變的具體機制以及防治措施目前尚不明晰。

心腦血管疾病,如動脈粥樣硬化、腦梗死和高血壓等的發(fā)生發(fā)展進程中多伴有血管重構[5]，包括血管外膜的纖維化、平滑肌層增厚和血管內(nèi)膜增生，機制復雜，涉及到血管壁炎癥、內(nèi)皮細胞損傷和平滑肌細胞過度增生等[5-7]。前期的研究提示，Hcy可通過多種途徑致使血管內(nèi)皮細胞的結構以及功能出現(xiàn)損傷[8]。在臍靜脈內(nèi)皮細胞中的研究顯示，Hcy可通過激活PERK信號通路致NF-κB磷酸化，進而導致內(nèi)皮細胞線粒體功能異常以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激促使細胞凋亡[9]。Meng等[10]的研究顯示內(nèi)皮細胞損傷所致的內(nèi)皮功能紊亂可促使細胞黏附分子和內(nèi)皮素等大量分泌，進而影響血管平滑肌細胞的結構與功能。Cao等[11]的研究表明，Hcy可刺激血管平滑肌細胞增殖；考慮到細胞生物學行為調(diào)控的復雜性，關于Hcy對腦基底動脈平滑肌細胞生物學行為的具體調(diào)控作用及可能的分子機制尚不完全清楚。

Rho家族蛋白是一類具有GTP酶活性的小分子單體GTP結合蛋白，依據(jù)其結構和功能可分為3個亞家族：Rho、Rac和Cdc42，其中Rho蛋白有3個亞型：RhoA、RhoB和RhoC[12]。RhoA可作為一種分子開關，在無活性的GDP結合型和有活性的GTP結合型之間進行轉(zhuǎn)換，進而通過下游的效應分子參與調(diào)節(jié)細胞的功能[13]。Rho相關的含卷曲螺旋蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil containing kinases，ROCK)是RhoA下游的效應分子之一，可調(diào)節(jié)細胞骨架成分及細胞運動；在細胞的增殖、收縮、遷移、凋亡和分化等方面都發(fā)揮著重要的作用[14]。大量的研究證明，RhoA/ROCK信號通路可通過多種機制影響血管內(nèi)皮細胞以及血管平滑肌細胞的生理功能，進而參與相關心血管疾病的進展過程[15-16]。

基于以上研究背景，本研究通過體外分離培養(yǎng)大鼠腦基底動脈平滑肌細胞(basilar arterial smooth muscle cells,BASMCs)，探討同型半胱氨酸處理對BASMCs的活力、細胞周期及遷移等生物學行為的影響，并利用ROCK抑制劑作為工具藥探討Rho激酶信號通路在其中的可能作用。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基及胎牛血清(fetal bovine se-rum，F(xiàn)BS)均購自Gibco；ROCK抑制劑Y-27632購自Sigma；抗GTP-RhoA、RhoA、ROCK2及β-actin抗體購自Cell Signaling Technology；CCK-8細胞活力分析試劑盒購于日本同仁化學研究所；細胞周期檢測試劑盒購于南京凱基公司；丙二醛(malondialdehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase， SOD)及谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase， GSH-Px)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 實驗方法

2.1細胞原代分離及體外培養(yǎng) 實驗用大鼠BASMCs采用組織塊原代分離培養(yǎng)的方法獲得，具體方法如下：實驗前預先準備含1%雙抗的冰Krebs液并通氧30 min。選用SPF級SD大鼠[體質(zhì)量(160±20)g，許可證號為SCXK(豫)2018-0004]2只，斷頭處死后直接將頭置于冰上，迅速開顱取出大鼠腦基底動脈轉(zhuǎn)移至冰Krebs液中。在生物超凈臺中小心將腦基底動脈周圍的結締組織剝離干凈，漂洗后轉(zhuǎn)移至含20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中，用眼科剪剪碎血管，轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5 d后可見組織塊周圍有血管平滑肌細胞爬出，常規(guī)半量換液。7 d后細胞生長融合出現(xiàn)“峰與谷”現(xiàn)象原瓶常規(guī)消化傳代，用抗α-平滑肌肌動蛋白免疫組化法進行細胞鑒定。實驗用細胞為第4代～第8代細胞。

2.2CCK-8法測定細胞活力 取原代分離的細胞培養(yǎng)至第4代后，取生長狀態(tài)良好的細胞以2×107/L的密度接種于96孔板中，加含1%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后分別加入終濃度為0.125、0.25、0.5、1和2 mmol/L的Hcy孵育，繼續(xù)于細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)22 h或46 h，然后向每孔加入10 μL的 CCK-8試劑，置于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h。最后用酶標儀測定各孔在450 nm處的吸光度(A)值。每組設置3個復孔取均值，另設單孔只加入培養(yǎng)基作空白對照。

2.3流式細胞術檢測細胞周期 各組細胞經(jīng)相應處理后，加不含EDTA的胰酶消化液收集細胞并用PBS漂洗3次。重懸細胞并將細胞密度調(diào)整至1×109/L；加70%的無水乙醇放置于4 ℃的冰箱中避光固定過夜。次日離心洗去乙醇后加碘化丙啶(propidium iodide，PI)染液于37 ℃水浴鍋中避光反應30 min。最后用流式細胞儀檢測Ex=488 nm處的熒光強度。細胞分組設置為對照(control)組和Hcy組，細胞培養(yǎng)基中含有終濃度為1 mmol/L的Hcy和ROCK抑制劑組(Y-27632，細胞培養(yǎng)基中含有終濃度為10 μmol/L的Y-27632和終濃度為1 mmol/L的Hcy)。

2.4劃痕實驗檢測細胞遷移 取生長狀態(tài)良好的細胞接種于6孔板中，待細胞生長融合至約90%時，沿垂直方向用10 μL的無菌槍頭作劃痕，加PBS沖洗2遍，同步化后加相應的刺激因子，于倒置相差顯微鏡下觀察24 h并拍照記錄細胞劃痕的修復情況。細胞分組設置同2.3。

2.5Transwell檢測細胞遷移 取生長狀態(tài)良好的細胞以2×108/L的密度接種于Transwell小室中，并在下室內(nèi)的常規(guī)培養(yǎng)基中加入相應的刺激因子，處理完畢后將細胞重新放回細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。PBS沖洗Transwell小室后用棉簽擦除小室內(nèi)側(cè)的細胞，將小室置于甲醇中固定，棄去固定液后加0.1%的結晶紫染色液， 最后用PBS漂洗干凈后將小室置于倒置顯微鏡下觀察拍照，并計數(shù)染色細胞的個數(shù)。細胞分組設置同2.3。

2.6試劑盒測定細胞氧化應激狀態(tài) 抗氧化酶SOD和GSH-Px的活性以及細胞上清液中MDA的含量檢測均依據(jù)公司提供的試劑盒說明書進行操作。細胞分組設置同2.3。

2.7Western blot測定蛋白表達 裂解提取各組細胞蛋白并采用BCA試劑盒測定蛋白濃度。依據(jù)測定結果調(diào)整各組蛋白的上樣量至70 μg，加入loading buffer(體積比=1∶4)，95 ℃水浴變性后進行SDS-PAGE。各蛋白分子經(jīng)電泳分離后電轉(zhuǎn)至PVDF膜，加5%脫脂牛奶(用TBST配制)于搖床上室溫封閉1.5 h。依據(jù)說明書要求加入相應的 I 抗, 置于4 ℃冰箱中孵育過夜；復溫后加TBST漂洗；再加入相應的 II 抗室溫孵育2 h。TBST漂洗后，于暗室中加ECL化學發(fā)光液顯影，定影并沖洗膠片。所得結果經(jīng)ImageJ行蛋白灰度半定量分析。

3 統(tǒng)計學處理

所得數(shù)據(jù)均錄入SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件中進行分析。實驗結果以6次重復實驗所得的均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。不同濃度Hcy作用大鼠腦基底動脈平滑肌細胞24 h與48 h對細胞活性的影響采用有交互作用的雙因素方差分析；其余組間比較采用單因素方差分析，各組均數(shù)間的兩兩比較用Bonferroni校正的t檢驗。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 Hcy對大鼠BASMCs活力及Rho激酶信號通路的影響

本實驗先采用不同濃度的Hcy刺激大鼠BASMCs，檢測其對細胞活力的影響。CCK-8實驗的結果顯示Hcy可濃度依賴性地提高BASMCs的細胞活力，且Hcy處理細胞48 h后所測得的A值顯著高于24 h處理組(P<0.05)，提示Hcy可提高BASMCs的細胞活力，見表1。

表1 Hcy對大鼠腦基底動脈平滑肌細胞活力的影響

Table 1. The effects of Hcy at different concentrations for different time on the viability of BASMCs (Mean±SD.n=6)

GroupA value24 h48 hControl0.35±0.010.47±0.02Hcy (0.125 mmol/L)0.37±0.010.51±0.01?△Hcy (0.25 mmol/L)0.43±0.02?0.55±0.02?△Hcy (0.5 mmol/L)0.47±0.02?0.59±0.02?△Hcy (1 mmol/L)0.52±0.03?0.64±0.02?△Hcy (2 mmol/L)0.59±0.02?0.71±0.03?△

*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsthe same concentration at 24 h.

同時測定了不同濃度Hcy對大鼠BASMCs中Rho激酶信號通路活性的影響,Western blot的結果顯示，Hcy可濃度依賴性地提高BASMCs中GTP-RhoA和ROCK2的蛋白表達(P<0.05)，見圖1，提示Hcy可提高Rho激酶信號通路的活性。

Figure 1. The activation of Rho/ROCK pathway in BASMCs. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

圖1 Hcy對大鼠腦基底動脈平滑肌細胞中Rho/ROCK信號通路的影響

2 Hcy通過Rho激酶信號通路影響大鼠BASMCs的細胞周期分布

流式細胞術結果顯示，Hcy(1 mmol/L)處理后BASMCs中G0/G1期細胞比例由(87.53±2.41)%下降至(52.35±2.56)%，與之相對應的S期細胞比例則由(7.69±1.03)%上升至(37.86±2.32)%(P<0.05)；給予ROCK抑制劑Y-27632(10 μmol/L)處理后BASMCs中G0/G1期細胞比例上升至(71.08±2.16)%，S期細胞的比例下降至(20.39±1.57)%(P<0.05),見圖2。上述結果表明Hcy可顯著促進大鼠BASMCs的G1/S期轉(zhuǎn)換，且該作用可被ROCK抑制劑阻斷；提示Hcy對大鼠腦基底動脈平滑肌細胞周期轉(zhuǎn)換的促進作用可能與Rho激酶信號通路相關。

3 Hcy通過Rho激酶信號通路影響大鼠BASMCs的遷移

劃痕實驗中，Hcy(1 mmol/L)處理后BASMCs的遷移距離由對照組的(132.25±9.46) μm上升至(187.92±10.37) μm；給予ROCK抑制劑Y-27632(10 μmol/L)處理后BASMCs的遷移距離則下降至(158.82±8.73) μm，見圖3A。

Transwell實驗中，Hcy(1 mmol/L)處理后BASMCs的相對遷移率上升至(162.35±8.54)%；給予ROCK抑制劑Y-27632(10 μmol/L)處理后BASMCs的相對遷移率則降低至(121.63±7.71)%，見圖3B。

上述結果表明Hcy可顯著促進大鼠BASMCs遷移，該作用可被ROCK抑制劑阻斷；提示Hcy對大鼠腦基底動脈平滑肌細胞遷移的促進作用可能與Rho激酶信號通路相關。

4 Hcy對大鼠BASMCs細胞氧化應激的影響

相對于control組細胞，Hcy(1 mmol/L)處理可降低BASMCs中SOD和GSH-Px的活性，同時升高MDA的含量(P<0.05)；相較于Hcy處理組，加入Y-27632(10 μmol/L)處理后，細胞內(nèi)SOD和GSH-Px的活性升高，MDA的含量降低(P<0.05)，見圖4。上述結果表明Hcy可誘導BASMCs氧化應激反應的發(fā)生，該作用可被ROCK抑制劑阻斷。

Figure 2. Y-27632 partly reversed Hcy-induced G1/S phase transition in BASMCs. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsHcy group.

圖2 Y-27632部分逆轉(zhuǎn)Hcy所致的BASMCs 周期G1/S轉(zhuǎn)換

Figure 3. Y-27632 inhibited the migration of BASMCs. A: the effect of Y-27632 on the wound healing induced by Hcy was measured by scratch test (×100); B: the effect of Y-27632 on Hcy-induced migration of BASMCs was measured by Transwell assay (×200). Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsHcy group.

圖3 Y-27632抑制BASMCs遷移

Figure 4. The effects of Hcy and Y-27632 on the oxidative stress in BASMCs. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsHcy group.

圖4 Hcy和Y-27632對大鼠腦基底動脈平滑肌細胞氧化應激水平的影響

討 論

關于同型半胱氨酸致心腦血管相關疾病的研究多集中于血管內(nèi)皮，本研究分析了同型半胱氨酸對大鼠BASMCs的活力、細胞周期及遷移等生物學行為的影響。本實驗首先通過Hcy刺激BASMCs，細胞活力檢測結果顯示Hcy可時間及劑量依賴性地提高BASMCs的活力，表明Hcy可能參與調(diào)控BASMCs的生長過程。血管平滑肌細胞的增殖是由細胞內(nèi)多條交錯復雜的信號通路共同調(diào)節(jié)的，增殖異?？蓪е卵芙Y構及功能出現(xiàn)改變，與高血壓和動脈粥樣硬化等心血管事件的發(fā)生密不可分[17]。近年來RhoA/ROCK在心腦血管領域的研究備受關注，其中 ROCK在動脈粥樣硬化、高血壓、血管狹窄和血管痙攣等心腦血管疾病的發(fā)病過程中均出現(xiàn)異常表達[18-19]。本研究檢測了Hcy刺激下，BASMCs中Rho激酶信號通路的活性，結果顯示，Hcy可濃度依賴地提高BASMCs中活化的RhoA(GTP-RhoA)和ROCK2的蛋白表達，提示Hcy可提高Rho激酶信號通路的活性。

采用ROCK抑制劑Y-27632作為工具藥，我們進一步分析了Hcy對BASMCs周期和遷移等的影響以及Rho激酶信號通路在其中的作用，結果顯示Hcy可促進BASMCs的細胞周期由G0/G1期向S期轉(zhuǎn)化，而ROCK抑制劑可部分逆轉(zhuǎn)該作用。此外，劃痕實驗和Transwell實驗的結果也顯示，Hcy可顯著促進大鼠BASMCs的遷移，該作用同樣可被ROCK抑制劑阻斷?？梢奌cy可參與調(diào)控大鼠腦基底動脈平滑肌細胞的增殖及遷移等生物學行為，且該作用可能是由Rho激酶信號通路介導。

關于Hcy致心腦血管疾病的體內(nèi)外研究顯示，Hcy干預不僅促使內(nèi)皮細胞損傷，且可誘導細胞氧化應激，抑制H2S的生成[20]。損傷因素作用于細胞一旦引起細胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)與氧化系統(tǒng)失平衡而生成大量的活性氧，就有可能影響到血管的功能及結構；進而進展為各種血管性疾病[21-22]。本研究分析了Hcy調(diào)控BASMCs生物學行為的過程中是否涉及到氧化應激的發(fā)生以及Rho激酶信號通路的作用。結果顯示，Hcy處理可降低BASMCs中SOD和GSH-Px的活性，同時升高MDA的含量；相較于Hcy處理組，加入Y-27632可部分逆轉(zhuǎn)該變化。以上結果提示Hcy可誘導BASMCs氧化應激反應，該作用可被ROCK抑制劑阻斷；但是Rho激酶信號通路在其中的具體作用機制以及涉及的上下游信號分子還有待進一步深入研究。

綜上所述，同型半胱氨酸可激活Rho激酶信號通路介導細胞內(nèi)氧化應激損傷，參與調(diào)控腦基底動脈平滑肌細胞的生長及遷移等生物學行為。本研究為同型半胱氨酸介導各類心血管相關疾病的機制提供了一定的理論依據(jù)，也為以同型半胱氨酸為靶點的藥物研發(fā)提供了初步的實驗資料。