黃偉峰， 黃玉蘭， 劉麗， 張林， 呂虹， 雷高鵬， 李莉， 劉科亮， 楊小蓉

(四川省疾病預(yù)防控制中心，成都610041)

隨著生命科學(xué)的迅速發(fā)展，實驗動物作為生命醫(yī)學(xué)研究的重要支撐條件(張越華，鄭秀青，2017)，其安全性和有效性越來越受到高度關(guān)注。按微生物、寄生蟲控制程度，實驗動物可分為4個等級，即普通動物、清潔動物、無特定病原體(specific pathogen free，SPF)動物和無菌動物(魏杰等，2014)。SPF動物是指除清潔動物應(yīng)排除的病原外，不攜帶主要潛在感染或條件致病和對科學(xué)實驗干擾大的病原的實驗動物(田攀，2016)。實驗動物感染病原體后在實驗過程中發(fā)病或死亡，影響生理指標，干擾實驗結(jié)果的可靠性和準確性，導(dǎo)致實驗失敗。由于對實驗動物質(zhì)量的要求越來越高，許多生命科學(xué)研究要求使用SPF級及以上等級。

但實驗動物飼養(yǎng)與實驗過程中外界環(huán)境的污染難以避免(姜光瑤等，2010)，實驗動物感染病原體的報道屢見不鮮。金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus(SA)是一種廣泛分布于環(huán)境中的革蘭氏陽性球菌，存在于空氣、土壤、水及物品上，在人和家畜的體表尤其在和外界相通的腔道中檢出率相當(dāng)高，也是實驗動物最常見的易感病原體(鄒自英等，2014)。為確保實驗動物質(zhì)量、避免污染，查找金黃色葡萄球菌的來源和分析污染鏈，本實驗室連續(xù)多年對某實驗動物飼養(yǎng)場進行了監(jiān)測和分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基與試劑7.5%氯化鈉肉湯、高鹽甘露醇瓊脂(SP)平板、血瓊脂平板、腦心浸出液肉湯、凍干兔血漿。

1.1.2 主要儀器全自動微生物生化鑒定儀VITEK 2 COMPACT系統(tǒng)(法國Biomerieux公司)、Veriti梯度PCR儀(美國ABI公司)、QIAxcel毛細管電泳儀(德國Qiagen公司)、脈沖場電泳儀(美國伯樂公司)、凝膠成像系統(tǒng)(美國伯樂公司)、水浴搖床(英國Grand公司)。

1.2 方法

1.2.1 標本采集2011—2017年共采集該實驗動物飼養(yǎng)場的SPF大鼠回盲腸內(nèi)容物35份；2017年采集實驗動物養(yǎng)殖室空氣自然沉降樣本2份，飼養(yǎng)人員鼻腔拭子8份，飼養(yǎng)人員手部涂抹拭子8份。

1.2.2 分離純化根據(jù)《實驗動物 金黃色葡萄球菌檢測方法(GB/T 14926.14-2001)》，標本直接劃線接種到SP平板、血瓊脂平板，36 ℃培養(yǎng)24 h，金黃色葡萄球菌在SP培養(yǎng)基上形成黃色菌落，在血瓊脂平板形成灰白色、周圍有β溶血環(huán)的菌落。挑出可疑菌落，進行全自動生化鑒定和血漿凝固酶實驗。鼻腔拭子、手部涂抹拭子根據(jù)《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗(GB 4789.10-2016)》進行處理。

1.2.3 金黃色葡萄球菌A蛋白(Staphylococcusprotein A， SPA)基因分型挑取金黃色葡萄球菌菌苔，用煮沸法提取DNA，PCR檢測SPA基因300～400 bp序列片段(Monacoetal.，2010)，引物F：5’-TAAAGACGATCCTTCGGTGAGC-3’，R：5’-CAGCAGTAGTGCCGTTTGCTT-3’。反應(yīng)體系為：上下游引物各1 μL、dNTP 4 μL、10×Buffer 5 μL、TaKaRa酶 0.3 μL、模板3 μL，無菌純水加至50 μL，混勻，離心。擴增條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。用毛細管電泳檢測PCR產(chǎn)物，并對陽性結(jié)果進行雙向測序。

1.2.4 脈沖場凝膠電泳(PFGE)實驗金黃色葡萄球菌PFGE標準分型方法參考美國CDC網(wǎng)站的方法(Centers for Disease Control and Prevention，2011)。取新鮮瓊脂純培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌懸濁于TE中，調(diào)節(jié)麥氏濃度至4.2～4.4。菌懸液加入溶葡萄球菌酶與等體積1% Seakem Gold瓊脂混合制作plug。然后置于含蛋白酶K的細胞裂解液中裂解2 h，再用TE清洗干凈。切2 mm寬膠塊用 Sma Ⅰ內(nèi)切酶酶切；標準菌株H9812用Xba Ⅰ內(nèi)切酶酶切。電泳條件為最小分子量40 kb、最大分子量400 kb，初始脈沖4.0 s、終末脈沖40.0 s，泵速設(shè)為70，電泳溫度14 ℃，電壓梯度6 V·cm-1，電場夾角120°，電泳時間19 h 30 min。結(jié)束后用0.1 μg·mL-1Gelred染色30 min，純水中脫色30 min，凝膠成像儀上讀取圖像并保存。

1.2.5 聚類分析方法使用BioNumerics 6.6進行數(shù)據(jù)分析。用不加權(quán)算術(shù)平均組對法(UPGMA)對PFGE指紋圖譜進行聚類分析(楊小蓉等，2014)；用最大似然法對SPA測序結(jié)果進行聚類分析。

2 結(jié)果

2.1 SPF大鼠中金黃色葡萄球菌檢出率

2011—2017年(2014、2016年未采集)采集的35份樣本檢出16株SA，檢出率45.71%。除2015年外，每年均從SPF大鼠中檢出SA，檢出率為2012年最低(20.00%)，2017年最高(100.00%)，2011、2013年均為60.00%(表1)。

表1 2011—2017年SPF大鼠中金黃色葡萄球菌檢出情況Table 1 Detection of Staphylococcus aureus in SPF rats during 2011-2017

2.2 飼養(yǎng)環(huán)境及飼養(yǎng)人員檢測結(jié)果

從采集的18份飼養(yǎng)環(huán)境及飼養(yǎng)人員樣本中檢出2株SA。其中，1份飼養(yǎng)環(huán)境空氣中檢出1株，1份飼養(yǎng)人員鼻腔拭子中檢出1株，飼養(yǎng)人員手部涂抹拭子中未檢出。

表2 飼養(yǎng)環(huán)境及飼養(yǎng)人員金黃色葡萄球菌檢出情況Table 2 Detection of Staphylococcus aureus inbreeding environment and rearing staff

2.3 SPA分型結(jié)果

該飼養(yǎng)場檢出的18株SA可分成5個SPA基因型別，T2360為主要型別(11株)，各菌株SPA型別見表3。對SPA測序結(jié)果用最大似然法進行聚類分析，5個SPA型別可以聚為4簇，聚類關(guān)系與分離年份有很強的相關(guān)性：2011年SPF大鼠的3株SA為T3022，與其他SPA型別的親緣關(guān)系較遠；2012年SPF大鼠的2株SA為T237；2013年和2017年SPF大鼠的11株SA都為T2360。雖然飼養(yǎng)場環(huán)境空氣中檢出菌株的SPA型別為T9001，但與來源于SPF大鼠的T2360聚為同一簇。飼養(yǎng)人員鼻腔檢出菌株的SPA型別為T127(圖1)。

圖1 18株金黃色葡萄球菌的SPA分型聚類分析Fig. 1 SPA typing of 18 Staphylococcus aureus strains

表3 18株金黃色葡萄球菌SPA分型結(jié)果Table 3 The result of SPA typing of 18 Staphylococcus aureus strains

圖2 18株金黃色葡萄球菌的PFGE分型聚類分析
Fig. 2 PFGE typing of 18Staphylococcusaureusstrains

2.4 PFGE分型結(jié)果

18株SA的PFGE有5個帶型，命名為SA1～SA5，可聚為2大類，一類由SA1和SA2組成，另一類由SA3～SA5組成；SA4為主要帶型，有11株SA。不同年份SPF大鼠中分離SA的PFGE帶型有明顯的差異：2011年、2012年的PFGE帶型與2013年、2017年差異較大；且2011年只有SA1一個帶型，2012年只有SA2一個帶型；2013年為SA3和SA4，2017年為SA4。飼養(yǎng)環(huán)境空氣、飼養(yǎng)人員中分離SA的PFGE帶型與SPF大鼠中SA的相似度分別為100.00%、86.90%。

3 討論

近年來，實驗動物中攜帶病原微生物多有報道，葛文平等(2012)檢測了5個單位不同品系SPF小鼠，發(fā)現(xiàn)其SA、肺炎克雷伯氏菌Klebsiellapneumoniae和銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa的攜帶率分別為1.875%、1.875%和1.250%；馮潔等(2015)在422只SPF小鼠中，SA、肺炎克雷伯氏菌和銅綠假單胞菌的分離率分別為2.37%、0.47%和5.21%；Nobuhito等(2013)發(fā)現(xiàn)上千只動物和樣本中SA感染率比其他病原體更高，小鼠為18.8%，大鼠為58.6%。本研究對某實驗動物飼養(yǎng)場SPF大鼠進行SA連續(xù)多年監(jiān)測，檢出率達45.71%，與Nobuhito等(2013)的報道較為一致。

SPA分型方法主要是基于對SPA基因X區(qū)域可變串聯(lián)重復(fù)序列(VNTRs)的多態(tài)性序列分析，由于編碼SPA的基因包含一定數(shù)目的24 bp重復(fù)序列，根據(jù)重復(fù)序列的數(shù)目、特征及排列順序不同而具有高度的多態(tài)性，且具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，適合分型(譚磊等，2008)。PFGE被認為是細菌分子分型的“金標準”，目前已被廣泛應(yīng)用于檢測不同來源菌株之間的關(guān)聯(lián)性(閆笑梅等，2009)。本研究運用這2種方法對分離株進行聚類分析，發(fā)現(xiàn)同一年份分離株的PFGE和SPA型別均一致，說明同一年份分離株來自同一克隆系，不同年份的分離株之間親緣關(guān)系與分離年份相關(guān)性很強，且各年份分離SA的PFGE和SPA型別基本一一對應(yīng)。T2360和T9001的SPA基因前面5個重復(fù)序列一致，且其SPA序列能夠聚為同一簇，說明有這2個型別的菌株親緣關(guān)系非常近，可能是SPA基因X區(qū)域的堿基突變導(dǎo)致從第6個重復(fù)序列發(fā)生改變而型別不一致。這也解釋了飼養(yǎng)環(huán)境空氣中分離的SA菌株2017043，雖然其SPA型(T9001)與SPF大鼠中的T2360不一致，但其PFGE帶型與2013年和2017年SPF大鼠中的均為同一帶型(SA4)，這與SPA聚類分析結(jié)果一致，說明2017年飼養(yǎng)環(huán)境空氣中分離的SA菌株與2013、2017年分離的SA菌株親緣關(guān)系很近，有可能來自同一克隆株。同樣，2013年SPF大鼠中的SA有2個PFGE帶型(SA3和SA4)對應(yīng)了同一個SPA型別(T2360)，但SA3與SA4的相似度為90.90%，親緣關(guān)系較遠，說明這一批SPF大鼠可能感染了不同來源的SA。

本研究結(jié)果推斷，飼養(yǎng)環(huán)境空氣中分離的SA與引起SPF大鼠感染的SA具有緊密聯(lián)系，很可能是引起SPF大鼠感染的污染源。當(dāng)然并不能忽視其他因素也有可能引起的實驗動物感染，比如引進受感染的種鼠或幼鼠未被檢出、飼養(yǎng)人員攜帶的病原微生物等。在飼養(yǎng)人員鼻腔拭子也分離到了SA菌株2017044，雖然其SPA型別與SPF大鼠中的不一致，PFGE帶型的相似度也僅為86.90%，不是引起本次實驗動物感染的菌株，卻是重要的潛在污染源。因此應(yīng)保持實驗動物飼養(yǎng)的無菌環(huán)境和工具清潔，加強動物密切接觸者的無菌操作規(guī)范，對每批引進種鼠或幼鼠進行檢測，并定期對飼養(yǎng)環(huán)境、飼養(yǎng)工具設(shè)備、飼養(yǎng)人員以及飼養(yǎng)動物進行病原微生物監(jiān)測，及時發(fā)現(xiàn)隱患，找到污染源，切斷傳播途徑，避免感染的發(fā)生，為實驗動物的質(zhì)量和飼養(yǎng)人員的健康提供保證。