王樹群， 奉永友， 陳波， 吳孔菊， 方俊， 謝意， 黃祥明

(成都大熊貓繁育研究基地，瀕危動物繁殖與保護遺傳省重點實驗室，成都610081)

大熊貓Ailuropodamelanoleuca是國家Ⅰ級重點保護野生動物，有“活化石”和“中國國寶”之稱，屬于食肉目Carnivora大熊貓科Ailuropodinae，雖然大熊貓幼仔初生體質量僅約為母體體質量的1/1 000，而體型相似的黑熊Ursusthibetanus幼仔的該比例為1/200～1/300(胡錦矗，2001)。經(jīng)多年探索，圈養(yǎng)大熊貓營養(yǎng)和管理技術逐漸成熟，幼仔的存活率在2005年達79.8%(趙學敏，2006)，且2006年育活初生體質量最輕的大熊貓幼仔(黃祥明等，2011)。2018年《大熊貓保護與繁殖國際大會暨大熊貓繁育技術委員會年會》發(fā)布數(shù)據(jù)，全球圈養(yǎng)大熊貓種群數(shù)量達到548只。大熊貓雙胞胎存活率也從45.5%(黃炎等，2001)提高到95%(王海瑞等，2015)。實踐證明，養(yǎng)育存活的大熊貓雙胞胎幼仔與單胎幼仔相比在生長、發(fā)育、繁殖能力上并無顯著差異，所以雙胞胎存活率的提高直接促進了整個圈養(yǎng)大熊貓種群繁殖效率的提高(王海瑞等，2015)。

雖然大熊貓雙胞胎存活率不斷提高，但是影響大熊貓雙胞胎生長發(fā)育因素的報道極少，因此，通過大熊貓母獸孕期增重、雙胞胎個體性別、雙胞胎性別類型(雙雄性、雙雌性和異性)和大熊貓幼仔的初生體質量等方面綜合分析研究大熊貓雙胞胎個體生長發(fā)育規(guī)律的影響因素，不僅可以有效指導不同性別和初生體質量大熊貓幼仔與大熊貓母獸孕期的營養(yǎng)供給，而且還可以為大熊貓雙胞胎幼仔生長發(fā)育的理論研究打下基礎。

1 材料和方法

1.1 研究對象

以成都大熊貓繁育研究基地的22只母獸及其在2013—2016年繁育的22對大熊貓雙胞胎(♂22，♀22)為研究對象，其中，2013年4對，2014年3對，2015年6對，2016年9對(表1)。

1.2 育幼管理

大熊貓雙胞胎幼仔采用人工輔助育幼：在產仔當日取出其中一只人工喂奶、護理，每隔1～1.5 h與母獸哺育的另一只交換，保證每只幼仔及時吃到初乳，1～5 d內遵循先在母獸處吃乳，若未吃到再進行人工補喂母乳或者配奶(由美贊臣A+和美國PetAg 幼犬奶粉與水混合形成的濃度25%的配奶)的飼喂原則，若幼仔無法含住乳頭，則人工將幼仔移到母獸乳頭處；此外，根據(jù)每只幼仔體質量增長、食欲等每天隨時調整返回母獸處的次數(shù)和補喂的人工配奶和母乳的數(shù)量；2～3月齡時每天早上將雙胞胎中的一只補喂人工配奶而另一只回到母獸處吃母乳，待其吃好母乳后，將另一只也返回母獸處，5月齡后除了每天晚上喂1次人工配奶外，2只幼仔全天與母獸待在一起；具體人工輔助方法、環(huán)境控制等參考黃祥明等(2001，2005)的標準；此外，早期每天定時稱量每只幼仔的體質量，3月齡后改為每晚稱量1次；母獸體質量每月定時稱量1次，母獸孕前體質量為母獸配種前的體質量，母獸分娩時體質量為母獸分娩前的體質量，母獸孕期增重=母獸分娩時體質量-母獸孕前體質量。

1.3 統(tǒng)計方法

母獸孕期增重、雙胞胎個體性別和雙胞胎性別類型與大熊貓雙胞胎幼仔初生體質量之間的關系、不同雙胞胎個體性別和不同初生體質量與不同月齡幼仔體質量之間的關系采用一般線性模型中的多變量方差分析。目前大熊貓母獸孕期增重尚無明確劃分標準，但在人類孕婦的相關研究中以孕期增重低于10 kg視為增重不足(孫正芳等，2013)，因此，本研究以孕期增重10 kg為標準。

用雙胞胎初生體質量差異程度(difference of birth mass，D)(張春麗，張寧，2012)表示1對雙胞胎2只個體的初生體質量差異值，可直觀表示出這 2只個體在母體內的生長發(fā)育情況，D=(Wmax-Wmin)×100/Wmax，其中，Wmax表示較大個體的體質量，Wmin表示較小個體的體質量。目前動物雙胞胎初生體質量差異程度尚無明確的劃分標準，但是人類雙胞胎以初生體質量差異≥20%作為診斷標準(楊孜，2009)，因此，本研究采用20%作為初生體質量差異分界線，并對雙胞胎性別類型和初生體質量差異程度進行Cramer’s V相關分析，而雙胞胎初生體質量差異程度則用χ2檢驗進行分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義，同時以Post hoc testing檢驗調整后的標化殘差判斷各組的差異，當調整后標化殘差的絕對值大于1.96時，差異有統(tǒng)計學意義。不同性別類型雙胞胎的平均初生體質量采用單因素方差分析。

表1 22對大熊貓雙胞胎幼仔基本信息Table 1 Basic information of 22 giant panda twin cubs

所有數(shù)據(jù)均在SPSS 20.0中進行分析，結果以平均值±標準誤表示。

2 結果

2.1 大熊貓雙胞胎初生體質量

大熊貓幼仔初生體質量差異分析結果顯示，雙胞胎性別類型顯著影響大熊貓幼仔初生體質量(P=0.015)，其中，雙雌性雙胞胎和異性雙胞胎中較大個體的初生體質量顯著大于較小個體(P<0.05)，但是母獸孕期增重(P=0.257)和雙胞胎個體性別(P=0.170)卻對大熊貓幼仔初生體質量無顯著影響(表2)。

不同雙胞胎性別類型的個體初生體質量差異程度不同(χ2=9.043，P=0.041)，且雙胞胎性別類型與幼仔初生體質量呈中等強度相關關系(Cramer’s V=0.492，P=0.030)：雙雌性雙胞胎個體的初生體質量差異集中于20%～40%(調整后的標化殘差：2.30)，極少低于20%(調整后的標化殘差：-2.00)；雙雄性雙胞胎個體的初生體質量差異小于20%(調整后的標化殘差：2.60)；異性雙胞胎個體的初生體質量差異雖然沒有統(tǒng)計學意義(調整后的標化殘差：1.8)，但差異程度大于40%。雙雌性雙胞胎個體的平均體質量為0.13 kg±0.01 kg，雙雄性的為0.15 kg±0.01 kg，異性的為0.14 kg±0.01 kg，但三者差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表3)。

2.2 大熊貓雙胞胎幼仔1～12月齡的體質量

分析1～12月齡大熊貓雙胞胎幼仔的體質量后發(fā)現(xiàn)，大熊貓幼仔個體性別、初生體質量及其交互作用對各月齡的體質量均無顯著作用(P>0.05)(表4)。

表2 不同雙胞胎性別類型、雙胞胎個體性別和母獸孕期增重對大熊貓雙胞胎幼仔體質量的影響Table 2 The effect of sex type of twins， individual sex and increasing of maternal gestational masson the birth mass of giant panda twin cubs

注： B. 雙胞胎中較大個體， S. 雙胞胎中較小個體；*雙胞胎的初生體質量差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)

Notes： B. individual with greater birth mass in twins， S. individual with lesser birth mass in twins；*there is a significant difference between the twins’ birth mass (P<0.05)

表3 雙胞胎個體的初生體質量差異Table 3 The difference of birth mass in twins

表4 不同雙胞胎個體性別和初生體質量對大熊貓幼仔體質量的影響Table 4 The effect of individual sex and birth mass on the body mass of giant panda twin cubs

3 分析與討論

3.1 雙胞胎性別類型對大熊貓幼仔初生體質量的影響

目前，關于動物的雙胞胎性別類型與初生體質量之間關系的報道極少，但在人類雙胞胎中研究較多(Fieni & Gramellini，2004；楊孜，2009；張春麗，張寧，2012)。人類雙胞胎初生體質量差異程度大于20%視為雙胞胎生長不一致，因雙胞胎類型(雙卵雙胞胎和單卵雙胞胎)不同，雙胞胎生長不一致的原因有所差異，其中雙卵雙胞胎生長不一致不僅有遺傳學方面生長潛能差異的原因，還有2個胎盤之一未能夠占據(jù)理想而有利的子宮內膜位置而得不到良好的血供和胎盤、系帶及胎兒等先天畸形的原因，但最主要的原因則是胎盤灌注不足；單卵雙胞胎生長不一致的原因則是由于胎盤間血管吻合所致的胎兒間血流不平衡和2個胎兒間胎盤分配不均或所屬胎盤種植部位不當，導致的營養(yǎng)和氧氣供應不均，從而使胎盤出現(xiàn)不均衡生長，而其中胎盤的氨基酸轉運損害是最重要的因素(Fieni & Gramellini，2004；楊孜，2009)；因此，引起胎兒的營養(yǎng)供給差異是導致雙胞胎生長不一致最直接的原因。

本研究中，雙胞胎性別類型顯著影響大熊貓雙胞胎個體的初生體質量(P=0.015)。相較于人類雙胞胎嬰兒初生體質量的差異程度(女性雙胞胎>異性雙胞胎>男性雙胞胎；張春麗，張寧，2012)，大熊貓雙胞胎初生體質量差異程度表現(xiàn)為異性雙胞胎>雌性雙胞胎>雄性雙胞胎，因此，大熊貓雙胞胎中存在雌性個體時2只個體的初生體質量差異程度較大的現(xiàn)象與人類一致；原因可能是大熊貓雙胞胎胎兒在母體內發(fā)育期間，懷雙胞胎的母獸體內雌激素約為懷單胞胎母獸體內雌激素的1.5倍，處于極高水平(王海瑞等，2015)，而動物妊娠早期雌激素可以干預延緩子宮內膜螺旋動脈重塑，抑制滋養(yǎng)層細胞侵襲，使胎盤結構出現(xiàn)異常，并且高雌激素水平會增加低體質量兒的風險(王樹芳，2015)，所以在高水平雌激素的胚胎期，雌性個體可能與另一個體競爭而影響其中一只個體胎盤的分配(布)、生長或結構，從而影響胎盤的營養(yǎng)供給和胎兒的生長發(fā)育。

3.2 雙胞胎個體性別與大熊貓雙胞胎幼仔初生體質量的關系

胎兒的生長發(fā)育受先天遺傳因素和母體子宮內環(huán)境共同影響，而雙胞胎共用1個子宮，這為研究胎兒發(fā)育提供了相對穩(wěn)定的母體環(huán)境。劉定震等(2001)認為雄性大熊貓初生體質量較雌性大，而李明喜(2004)卻認為雌性大熊貓初生體質量較雄性大；相較于大熊貓，眾多學者研究了人類性別對嬰兒初生體質量的影響，認為由于男性與女性遺傳組成的差異，特別是Y染色體在對胎兒的體質量增長、形體發(fā)育、骨骼成熟和牙齒發(fā)育等方面可能存在的特別作用，從而使擁有XY染色體的男嬰初生體質量比具有XX染色體的女嬰更大(?arkoetal.，1985；Glinianaiaetal.，2000；饒騰子等，2012)。在本研究中，大熊貓雙胞胎個體性別對幼仔初生體質量未產生影響(P=0.170)，其原因可能是不同雙胞胎性別類型2只個體間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，所以不同性別類型雙胞胎總體發(fā)育較為一致。此外，在人類雙胞胎中，當異性雙胞胎孕齡與女性雙胞胎相近，但長于男性雙胞胎時，異性雙胞胎的女性個體初生體質量則同女性雙胞胎相近，而異性雙胞胎的男性個體初生體質量卻比男性雙胞胎大(Loosetal.，2001)，由此可見，胎兒孕齡影響其生長發(fā)育；而在妊娠期由于受光周期、哺乳刺激、營養(yǎng)或者激素等因素的影響，大熊貓胚胎在發(fā)育到胚泡階段時暫時進入休眠狀態(tài)并不立即著床，在這個時期，胚泡或者停止細胞分化與增長，以使其大小及內部細胞數(shù)量保持穩(wěn)定，或者經(jīng)歷一個少量細胞發(fā)生分化的緩慢增長階段，在子宮內漂浮游離較長一段時間，當環(huán)境適宜后，游離胚胎才開始在子宮內著床并分化形成胎兒(Hodgesetal.，1984；欒黎明等，2005；Zhangetal.，2009)，而大熊貓雙胞胎的這種延遲著床現(xiàn)象比單胎更為明顯，因此，雖然大熊貓胚胎表現(xiàn)出的妊娠期最短85 d，最長201 d(王海瑞等，2015)，但是胎兒在母獸體內檢出到產仔的時間卻只有20～25 d(Kerseyetal.，2016)。所以，在各種性別類型雙胞胎總體發(fā)育一致和極短的子宮內發(fā)育時間的條件下，大熊貓幼仔可能還沒有機會表達出雌雄個體間初生體質量的差異。

3.3 母獸孕期增重與大熊貓雙胞胎幼仔初生體質量的關系

目前，關于孕期增重與嬰兒初生體質量關系的報道常見于人類孕婦(李荔荔等，2014；陳亞紅，葛麗亞，2016；毛亞飛等，2017)。一般認為孕婦自身的營養(yǎng)狀況尤其是孕期的營養(yǎng)與胎兒的生長和嬰兒初生體質量密切相關，而孕婦孕期增重則可以綜合反映孕婦健康和營養(yǎng)狀況；據(jù)報道，孕婦孕期增重與嬰兒初生體質量呈正相關(李荔荔等，2014；毛亞飛等，2017)，是影響嬰兒初生體質量的重要因素(陳亞紅等，2016)，當孕婦孕期增重不足時，胎兒不僅可能無法達到其應有的生長潛力而小于胎齡出現(xiàn)胎兒生長受限的現(xiàn)象(施夢瑤等，2017)，而且還可能誘使胎兒早產(李荔荔等，2014)。在本研究中，大熊貓母獸孕期增重對幼仔的初生體質量無明顯影響(P=0.257)，其原因可能是由于孕前期胚胎在子宮內主要完成細胞分化、器官發(fā)育和胎盤功能建立，孕中晚期胚胎完成器官發(fā)育和胎盤功能建立后，能量才主要用于骨骼、肌肉和脂肪的生長，實現(xiàn)胎兒體質量快速增加(陳亞紅，葛麗亞，2016)，但是大熊貓胚胎發(fā)育不僅有延遲著床現(xiàn)象，而且胎兒在子宮內生長期不足1個月，所以大熊貓幼仔胚胎期物質快速積累的時間極短，母獸孕期增重對其物質積累影響有限。

3.4 雙胞胎個體性別和幼仔初生體質量對大熊貓幼仔1～12月齡體質量的影響

大熊貓雙胞胎個體性別和幼仔初生體質量與幼仔生長發(fā)育之間關系的報道較多。劉定震等(2002)和褚青坡等(2019)報道認為雄性大熊貓個體初生體質量大于雌性，由于大熊貓屬于典型的晚成性哺乳動物，初生幼仔裸露無毛，雙眼未睜，無聽覺能力，極為弱小，對母獸的依賴性強，除了由母獸負責安全、保暖和清潔衛(wèi)生，主要靠從母乳中獲取營養(yǎng)，因而初生幼仔對母乳的獲取能力、母獸的營養(yǎng)狀況和哺育能力成為決定幼仔生長發(fā)育的主要因素，而雄性個體的初生體質量較大，在成長過程中競爭力更強、生長速率更快。通過對家畜初生體質量和性別對其生長發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)荷斯坦奶牛12月齡體質量、薩?？搜?月齡體質量和仔豬20日齡及60日齡體質量與其初生體質量相關(曹進夫，1999；鄧勇等，2000；顧亞玲等，2008)，并認為雄性個體生長發(fā)育快，異化作用強，在營養(yǎng)豐富條件下的體質量比雌性大。在本研究中，大熊貓幼仔在1～12月齡期間，初生體質量較大個體與較小個體的生長發(fā)育并未表現(xiàn)出有統(tǒng)計學意義的差異(P>0.05)，并且不同性別大熊貓幼仔的體質量增長與張和民等(2003)和李明喜(2004)的報道一致，其原因可能是劉定震等(2002)和褚青坡等(2019)報道的大熊貓幼仔采用的是母獸直接哺育，因而在大熊貓雙胞胎幼仔生長發(fā)育早期，初生體質量較大個體的活動能力較大，母乳獲取能力更強，生長發(fā)育更快；而初生體質量過小的幼仔往往無力尋找母獸的乳頭和吮吸乳汁而導致生長發(fā)育受限。本研究中的大熊貓幼仔不僅初生體質量在性別間無差異而且在生長發(fā)育早期皆采用人工輔助育幼，從而避免了體弱個體難以與體強個體競爭的問題，而且當幼仔在母獸處吃母乳時，人工將幼仔移至母獸乳頭處，讓幼仔吸乳，并設法讓母獸不將幼仔移開(黃祥明等，2005)，也避免了體弱個體找不到乳頭的問題，確保了大熊貓雙胞胎幼仔都獲得充足的初乳和母乳，因此，大熊貓幼仔在1～12月齡期間，人工輔助育幼可能降低了不同初生體質量對其生長發(fā)育的影響。雖然成年雄性大熊貓體質量略大于成年雌性(馮文和，張安居，1988)，但在1～12月齡的生長發(fā)育中未能表現(xiàn)出性別間的差異，可能是人工輔助育幼延遲了其性別效應。