孜拉吉古麗·西克然木， 馬紀(jì)， 庫(kù)爾班·吐松， 劉小寧

(新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊830046)

昆蟲(chóng)的分布、生長(zhǎng)與其生存環(huán)境緊密相關(guān)。對(duì)許多生物體來(lái)說(shuō)，溫度是最重要的環(huán)境因素，它通過(guò)誘導(dǎo)許多生理反應(yīng)來(lái)影響生物生長(zhǎng)繁殖、分布和豐度(Parmesan，2006；Angillettaetal.，2010；Jiaetal.，2011)。任何環(huán)境溫度的變化均會(huì)引起昆蟲(chóng)體內(nèi)一系列的生理響應(yīng)，包括低溫脅迫(史亮等，2013)。當(dāng)昆蟲(chóng)處于低溫脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的酶促反應(yīng)速率下降，呼吸鏈某些點(diǎn)的三磷酸腺苷(ATP)需求和電子積累減少，這種情況促使一些活性氧(ROS)突然增加，引起機(jī)體內(nèi)ROS的積累而導(dǎo)致氧化應(yīng)激(Chattopadhyay，2002)。超氧陰離子自由基(O2·-)通常是第一個(gè)產(chǎn)生的ROS。O2·-的產(chǎn)生可能引發(fā)更多反應(yīng)性ROS(OH-、ONO2-、HOO·)的形成，這些反應(yīng)性ROS可能對(duì)生物大分子，包括膜脂、蛋白質(zhì)、核酸和其他細(xì)胞成分造成潛在的破壞(Gill & Tuteja，2010)。荒漠昆蟲(chóng)經(jīng)常遭受惡劣環(huán)境的影響，如寒冷的氣候(S?mme，1995)。因此昆蟲(chóng)在適應(yīng)環(huán)境的自我保護(hù)調(diào)節(jié)中，為抵御自由基的傷害，形成了一整套高效的抗氧化系統(tǒng)，以清除和解毒累積的氧自由基(馮從經(jīng)等，2002；Hermeslima & Zentenosavín，2002；杜堯，2007)。

超氧化物歧化酶(SOD)是生物體中的主要抗氧化酶家族，被認(rèn)為是抗氧化防御系統(tǒng)的第一道防線(xiàn)，通過(guò)將超氧化物轉(zhuǎn)化為H2O2和水來(lái)抵抗氧化應(yīng)激(Ackerman & Brinkley，1966；Mccord & Fridovich，1988)。SOD的獨(dú)特之處在于其活性決定了2種Haber-Weiss反應(yīng)底物O2和H2O2的濃度，因此它是防御機(jī)制的核心(Gill & Tuteja，2010)。在真核生物中，SOD有3種清楚的亞型：一種是定位于細(xì)胞質(zhì)中的Cu/Zn-SOD，即SOD1，一種是定位于細(xì)胞外的EC-SOD，即SOD3，還有一種以Mn為輔助因子的SOD，即Mn-SOD，也被稱(chēng)為SOD2(Zelkoetal.，2002)。

小胸鱉甲Micorderapunctipennis隸屬于鞘翅目Coleoptera擬步甲科Tenebrionidae，為生活在中國(guó)西北部新疆古爾班通古特沙漠的一種特有種，該地區(qū)1月土壤表面和土壤下5 cm的平均溫度分別為-12 ℃和5 ℃，因此其成蟲(chóng)具有很強(qiáng)的耐寒性，且存在冷馴化機(jī)制(黃人鑫等，2005)。小胸鱉甲在低溫冷馴化過(guò)程中可能會(huì)受到自由基的傷害，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激。課題組前期對(duì)小胸鱉甲低溫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行GO分析，結(jié)果表明SOD是相應(yīng)低溫脅迫反應(yīng)的8個(gè)顯著上調(diào)的基因之一(庫(kù)爾班·吐松等，2016)。因此，抗氧化應(yīng)激是小胸鱉甲對(duì)冷應(yīng)激反應(yīng)的一個(gè)重要方面。本研究將小胸鱉甲胞外Cu/Zn-SOD基因與pET-32a表達(dá)載體連接，在大腸桿菌Escherichiacoli中誘導(dǎo)表達(dá)出目的蛋白Trx-His-MpecCu/Zn-SOD，重組蛋白分子量約為42 kDa。利用Ni2+親和純化獲得了這種重組蛋白Trx-His-MpecCu/Zn-SOD，并對(duì)純化的重組蛋白的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了分析。同時(shí)制備了該重組蛋白的多克隆抗體。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究ecCu/Zn-SOD的功能及其在昆蟲(chóng)中的耐寒性機(jī)制提供了有效的檢測(cè)工具。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

小胸鱉甲收集于新疆維吾爾自治區(qū)阜康市222團(tuán)(87°51′E，44°24′N(xiāo))的準(zhǔn)噶爾盆地古爾班通古特沙漠南緣地帶。將樣品帶回實(shí)驗(yàn)室并在30 ℃±0.5 ℃、16 h∶8 h(光照∶黑暗)光周期、相對(duì)濕度為30%±6%條件下用麥麩和新鮮卷心菜葉飼養(yǎng)。黃粉蟲(chóng)Tenebriomolitor在飼養(yǎng)室進(jìn)行人工飼養(yǎng)。KM小鼠購(gòu)于新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(新)2018-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(新)2018-0003]。蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量Marker和BCA蛋白濃度定量試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher Scientific。小鼠抗His-tag抗體(TA-02，IgG1)、辣根過(guò)氧化物(HRP)酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體[ZB-2305，IgG(H+L)]和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液購(gòu)于Life Technologies；Ni2+親和層析系統(tǒng)為Novagene產(chǎn)品；ELISA板購(gòu)自廣州潔特生物過(guò)濾制品有限公司，其余化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 重組蛋白Trx-His-MpecCu/Zn-SOD的誘導(dǎo)表達(dá)與純化前期構(gòu)建并鑒定正確的pET32a-MpecCu/Zn-SOD重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)，保存于30%甘油中。挑取重組子于含有氨芐的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 220 r·min-1震蕩過(guò)夜培養(yǎng)。次日以1∶100轉(zhuǎn)接于新鮮LB(含氨芐)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，至OD600為0.5時(shí)，加入終濃度為0.3 mmol·L-1的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，22 ℃ 100 r·min-16 h。同時(shí)設(shè)pET32a(+)空載體菌為誘導(dǎo)對(duì)照。取1 mL上述誘導(dǎo)的大腸桿菌經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，超聲裂解，12 000 r·min-15 min。分別收獲上清和沉淀，等量上樣，觀(guān)察上清液和細(xì)胞沉淀的含量，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，考馬斯亮藍(lán)R250染色2 h后脫色過(guò)夜，檢測(cè)重組蛋白的可溶性表達(dá)。

將含有重組質(zhì)粒pET32a-MpecCu/Zn-SOD的BL21(DE3)菌株接種于含有氨芐(50 μg·mL-1)的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 220 r·min-1震蕩培養(yǎng)至OD600=0.5時(shí)加入終濃度為0.3 mmol·L-1的IPTG于22 ℃ 100 r·min-16 h，12 000 r·min-110 min，收集菌體，以PBS洗滌2次并重懸沉淀，超聲破碎菌體，12 000 r·min-110 min，收集沉淀。在8 mol·L-1尿素中4 ℃過(guò)夜變性。次日，將總蛋白吸附到5 mmol·L-1咪唑(pH8.0)平衡柱子上3 h，然后分別用20 mmol·L-1咪唑(pH8.0)洗3次后，再用50 mmol·L-1、75 mmol·L-1、100 mmol·L-1、120 mmol·L-1、200 mmol·L-1咪唑(pH8.0)通過(guò)His-Trap親和柱進(jìn)行洗脫純化。含6 mol·L-1尿素的PBS 4 ℃透析過(guò)夜。接著分別用含4.0 mol·L-1、3.0 mol·L-1、2.0 mol·L-1、1.0 mol·L-1、0 mol·L-1梯度濃度的尿素1×PBS透析各4 h，12 000 r·min-15 min，上清即為可溶性的復(fù)性蛋白。用聚乙二醇超濾濃縮，小管分裝，-80 ℃保存。SDS-PAGE檢測(cè)蛋白質(zhì)純化情況并確定最佳洗脫濃度。然后用BCA蛋白濃度定量試劑盒進(jìn)行定量。

將20 μL純化的重組蛋白Trx-His-MpecCu/Zn-SOD進(jìn)行12%SDS-PAGE后，在50 mA下電泳轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，然后用5%脫脂奶粉在4 ℃下封閉過(guò)夜。次日將封閉的膜在磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)中洗滌3次，每次5 min，并以小鼠抗His IgG1(1∶1 000稀釋)作為一抗，以帶辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG(稀釋度為1∶5 000)作為二抗，于DAB中顯色并拍照。

1.2.2 重組蛋白Trx-His-MpecCu/Zn-SOD的部分酶學(xué)性質(zhì)分析采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定純化后的Trx-His-MpecCu/Zn-SOD濃度，重復(fù)取樣測(cè)定3次，最后根據(jù)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算目的蛋白濃度。參照SOD試劑盒(測(cè)分型)說(shuō)明書(shū)(南京建成生物科技有限公司)，采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定純化后的Trx-His-MpecCu/Zn-SOD的酶活性。

取純化好的Trx-His-MpecCu/Zn-SOD，檢測(cè)溫度、pH對(duì)該蛋白酶活性的影響，為減少誤差，每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行組，并重復(fù)測(cè)定3次。溫度處理組中，取等體積純化后的Trx-His-MpecCu/Zn-SOD溶液于試管中，分別置于15 ℃、25 ℃、35 ℃、45 ℃、55 ℃、65 ℃水浴鍋中，保溫20 min，再用酶標(biāo)儀分別測(cè)定各組的吸光值，計(jì)算酶活性。在pH處理組中，將等體積SOD純化酶液分別加入pH5、6、7、8、9、10、11、12的緩沖液體系中，室溫孵育30 min后測(cè)定酶活性。緩沖體系的配置分別為0.2 mol·L-1Citrate Buffer(pH2、3、4、5和6)，0.2 mol·L-1Tris-HCl Buffer(pH7、8和9)以及0.2 mol·L-1Glycine/NaOH Buffer(pH10、11、12)。

1.2.3 多克隆抗體的制備及特異性分析免疫前，用眼眶采血法收集5只小鼠血液，每只300 μL，37 ℃ 30 min，4 ℃ 1 h，3 500 r·min-110 min，上層血清-80 ℃保存，作為陰性對(duì)照。純化的重組蛋白Trx-His-MpecCu/Zn-SOD作為抗原免疫小鼠：每只小鼠用50 μg重組蛋白與等體積的弗氏完全佐劑乳化，足墊和皮下注射；14 d后，50 μg重組蛋白與等體積的弗氏不完全佐劑乳化，足墊和皮下注射免疫；之后每隔15～20 d加強(qiáng)免疫1次，共2次。免疫后分別收集血清，-80 ℃保存。

純化的重組蛋白經(jīng)包被液稀釋?zhuān)乖K濃度為5 μg·mL-1，96孔板每孔加入150 μL稀釋的抗原包被酶標(biāo)反應(yīng)板，4 ℃過(guò)夜。次日用PBST洗滌3次，每次5 min；每孔加入200 μL含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%脫脂奶粉的PBST封閉，37 ℃ 2 h，洗滌同上；每孔加入150 μL按比例稀釋的抗血清(用2.5%脫脂奶粉稀釋)，37 ℃ 1 h，洗滌3次。每孔加入100 μL HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗(封閉液為1∶5 000)，37 ℃ 1 h，洗滌同上；加入100 μL TMB顯色液顯色10 min，最后每孔加入100 μL 2 mol·L-1終止液H2SO4，終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下立即測(cè)定吸光值(OD)。

參照楊穎等(2011)的方法配制水溶性蛋白裂解液(100 mmol·L-1Tris，7 mol·L-1尿素，0.02 mol·L-1乙二胺四乙酸，65 mmol·L-1二硫蘇糖醇)，冰浴30 min。用滅菌的H2O沖洗干凈小胸鱉甲7齡幼蟲(chóng)(末期幼蟲(chóng))，用液氮研磨后溶于抽提液中冰浴30 min。4 ℃ 12 000 r·min-120 min，上清液即為小胸鱉甲總蛋白。將小胸鱉甲的天然總蛋白和黃粉蟲(chóng)天然總蛋白在SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，經(jīng)過(guò)一抗(MpecCu/Zn-SOD抗血清)和二抗(HRP)處理后于DAB中顯色，顯色時(shí)間約為2 min，并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組蛋白Trx-His-MpecCu/Zn-SOD的純化

經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，沉淀中包含大量重組蛋白，以不溶于水的包涵體形式存在(圖1：A)。將含有pET32a-MpecCu/Zn-SOD表達(dá)質(zhì)粒的BL21(DE3)菌體超聲破碎，將上清加載到親和柱上，以不同濃度咪唑洗脫，SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果顯示，Trx-His-MpecCu/Zn-SOD能被20 mmol·L-1、50 mmol·L-1、75 mmol·L-1、100 mmol·L-1、120 mmol·L-1濃度咪唑的洗脫液洗脫，其中120 mmol·L-1為最佳洗脫濃度(圖1：A)。以Anti-his抗體作為一抗，用HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗，鑒定純化的重組蛋白Trx-His-MpecCu/Zn-SOD，結(jié)果顯示，雜交出的條帶大小與預(yù)計(jì)的42 kDa相符合(圖1：B)，進(jìn)一步說(shuō)明誘導(dǎo)及純化的重組蛋白是目的重組蛋白。

2.2 純化重組蛋白Trx-His-MpecCu/Zn-SOD的部分酶學(xué)性質(zhì)

純化后的Trx-His-MpecCu/Zn-SOD濃度為1.33 mg·mL-1，酶活性為27.52 U·mg-1。在不同溫度下處理30 min后，重組Trx-His-MpecCu/Zn-SOD的活性在35 ℃最高，為13.05 U·mg-1；與其他溫度下測(cè)得的酶活性比較，在25～45 ℃保溫30 min后的MpecCu/Zn-SOD的酶活性穩(wěn)定，相對(duì)酶活性保持在65%以上；低溫和高溫處理均會(huì)導(dǎo)致該酶活性的減弱，在65 ℃高溫處理后，相對(duì)酶活性迅速降至幾乎為0(圖2：A)。pH值為5.0～9.0時(shí)，Trx-His-MpecCu/Zn-SOD的酶活性隨著pH值升高逐漸升高，pH為9時(shí)的酶活性最高；當(dāng)pH>9時(shí)，酶活性則隨著pH值升高迅速降低(圖2：B)。

圖1 重組蛋白Trx-His-MpecCu/Zn-SOD的誘導(dǎo)表達(dá)與純化Fig. 1 Induced expression and purication of fusion Trx-His-MpecCu/Zn-SOD protein

M.蛋白Marker； A. SDS-PAGE分析結(jié)果： 1. 未誘導(dǎo)的細(xì)菌總蛋白， 2. 誘導(dǎo)的Trx-His-MpecCu/Zn-SOD總蛋白， 3. Trx-His-MpecCu/Zn-SOD裂解上清， 4. Trx-His-MpecCu/Zn-SOD裂解沉淀， 5～9. 20 mmol·L-1、50 mmol·L-1、75 mmol·L-1、100 mmol·L-1和120 mmol·L-1咪唑濃度洗脫液洗脫的蛋白條帶； B. Western blot分析結(jié)果： 1. 未誘導(dǎo)的細(xì)菌總蛋白， 2. 誘導(dǎo)的Trx-His-MpecCu/Zn-SOD總蛋白

M. protein Marker； A. result of SDS-PAGE analysis： 1.uninduced bacterial total protein， 2. induced Trx-His-MpecCu/Zn-SOD total protein， 3. Trx-His-MpecCu/Zn-SOD lysis supernatant， 4. Trx-His-MpecCu/Zn-SOD lysis deposit， 5-9. protein strip eluted by 20 mmol·L-1， 50 mmol·L-1， 75 mmol·L-1， 100 mmol·L-1和120 mmol·L-1imidazole concentration eluent， respectively； B. result of Western blot： 1. uninduced bacterial total protein， 2. induced Trx-His-MpecCu/Zn-SOD bacterial total protein

圖2 溫度(A)和pH(B)對(duì)重組蛋白Trx-His-MpecCu/Zn-SOD 酶活力的影響Fig. 2 Effect of temperature (A) and pH (B) on the activity of fusion Trx-His-MpecCu/Zn-SOD protein

2.3 ELISA檢測(cè)抗血清的效價(jià)

用重組蛋白Trx-His-MpecCu/Zn-SOD免疫小鼠3次后，ELISA方法測(cè)定抗血清效價(jià)(圖3)。當(dāng)血清稀釋819 200倍時(shí)，樣品在450 nm的光吸收值大于陰性對(duì)照的2.1倍，即抗血清的滴度約為819 200。

圖3 ELISA測(cè)定Trx-His-MpecCu/Zn-SOD抗血清效價(jià)Fig. 3 ELISA assay for Trx-His-MpecCu/Zn-SOD antiserum titer

2.4 Trx-His-MpecCu/Zn-SOD抗血清免疫特異性檢測(cè)

以制備的抗Trx-His-MpecCu/Zn-SOD抗血清作為一抗，以羊抗鼠IgG-HRP作為二抗，以大腸桿菌DH5α菌體重組蛋白Trx-His-MpecCu/Zn-SOD、小胸鱉甲總蛋白和黃粉蟲(chóng)總蛋白作為抗原進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果顯示，所制備的抗血清能夠與重組蛋白結(jié)合且與預(yù)期條帶大小相符(42 kDa)(圖4：A)，也能與小胸鱉甲體內(nèi)天然的MpecCu/Zn-SOD結(jié)合，條帶大小與理論大小相符(23 kDa)，而與黃粉蟲(chóng)的總蛋白無(wú)雜交條帶(圖4：B)。表明制備的抗Trx-His-MpecCu/Zn-SOD的抗血清對(duì)小胸鱉甲體內(nèi)的MpecCu/Zn-SOD具有較好的免疫特異性。

3 討論

SOD作為生物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的重要防線(xiàn)，在昆蟲(chóng)等節(jié)肢動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境脅迫過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用(Yangetal.，2010)。研究表明，當(dāng)各種環(huán)境脅迫，包括低溫使昆蟲(chóng)體內(nèi)電子傳遞鏈?zhǔn)艿綋p傷，產(chǎn)生大量的O2·-時(shí)，其體內(nèi)的胞外Cu/Zn-SOD(ecCu/Zn-SOD)發(fā)揮著重要的抗氧化防御功能(岳宗豪等，2014；劉云財(cái)?shù)龋?018)。目前有關(guān)昆蟲(chóng)的研究主要集中在icCu/Zn-SOD，而對(duì)ecCu/Zn-SOD的作用機(jī)制研究較少(劉云財(cái)?shù)龋?018)。小胸鱉甲作為古爾班通古特沙漠的特有種，體內(nèi)的ecCu/Zn-SOD是否能在抵抗外界寒冷的環(huán)境中發(fā)揮作用需要進(jìn)一步通過(guò)分子生物學(xué)的手段來(lái)證明，而制備特異性強(qiáng)、高效價(jià)的ecCu/Zn-SOD抗體是深入開(kāi)展相關(guān)研究的基礎(chǔ)之一。本文將小胸鱉甲ecCu/Zn-SOD構(gòu)建至pET-32a表達(dá)質(zhì)粒上，在大腸桿菌中成功誘導(dǎo)出重組蛋白Trx-His-MpecCu/Zn-SOD。誘導(dǎo)出的重組蛋白在大腸桿菌主要以包涵體的形式存在于沉淀中，通過(guò)Ni2+親和層析純化得到比較單一的重組蛋白Trx-His-MpecCu/Zn-SOD，用尿素復(fù)性后，測(cè)得的蛋白濃度為1.33 mg·mL-1，活力為27.3 U·mg-1，Western blot的結(jié)果驗(yàn)證該重組蛋白的正確性。

圖4 Trx-His-MpecCu/Zn-SOD抗血清的免疫特異性檢測(cè)
Fig. 4 Immunospecific detection of Trx-His-MpecCu/Zn-SOD antiserum

M.蛋白Marker； A. Western blot分析結(jié)果： 1. 未誘導(dǎo)細(xì)菌的總蛋白重組蛋白， 2. Trx-His-MpecCu/Zn-SOD； B. SDS-PAGE分析結(jié)果： 1. 黃粉蟲(chóng)總蛋白， 2. 小胸鱉甲總蛋白； C. Western blot分析結(jié)果： 1. 黃粉蟲(chóng)總蛋白， 2. 小胸鱉甲總蛋白

M. protein Marker； A. result of Western blot： 1.uninduced bacterial total protein， 2. fusion protein Trx-His-MpecCu/Zn-SOD； B. result of SDS-PAGE analysis： 1.Tenebriomolitortotal protein， 2.Micorderapunctipennistotal protein； C. result of Western blot： 1.T.molitortotal protein， 2.M.punctipennistotal protein

Cu/Zn-SOD是一種金屬蛋白酶，酶活性受到pH、溫度等因素的影響(田春美，鐘秋平，2005)。柑桔全爪螨Panonychuscitri重組蛋白ecCu/Zn-SOD在25～70 ℃表現(xiàn)出廣泛的溫度耐受性(Fengetal.，2015)。翹嘴鱖Sinipercachuatsi重組蛋白Cu/Zn-SOD在25～60 ℃保持75%以上的酶活性(肖俊等，2017)。本研究中小胸鱉甲ecCu/Zn-SOD在25～45 ℃具有比較穩(wěn)定的酶活性，低溫和高溫處理能夠減弱該酶活性，可能是因?yàn)榧兓@得的重組蛋白是以包涵體的形式存在，需要進(jìn)行變性和復(fù)性。有研究表明，通過(guò)生物提取的icCu/Zn-SOD和ecCu/Zn-SOD相比，復(fù)性的ecCu/Zn-SOD熱穩(wěn)定性顯著降低(朱希強(qiáng)，袁勤生，2005)。尤其是大腸桿菌表達(dá)及純化并變性復(fù)性后的MpecCu/Zn-SOD僅在10～50 ℃有酶活性。溫度高于60 ℃，其穩(wěn)定性開(kāi)始迅速降低。這與本研究結(jié)果一致。

天然形式Cu/Zn-SOD酶結(jié)構(gòu)在pH5.3～9.5保持不變，顯示出極強(qiáng)的穩(wěn)定性(Salin & Oesterhelt，1988)。大多數(shù)重組蛋白Cu/Zn-SOD在pH2.0～10.5均具有很高的酶活性(劉建榮等，2007；Baoetal.，2009；Xuetal.，2010；肖俊等，2017)。另外斑馬魚(yú)Daniorerio的重組蛋白Cu/Zn-SOD在pH7.5～11均具有很高的酶活性(Kenetal.，2003)。本研究中MpecCu/Zn-SOD也表現(xiàn)出比較廣泛的酸堿耐受性，表明其酶活性相對(duì)穩(wěn)定。另一方面，以純化的重組蛋白Trx-His-MpecCu/Zn-SOD作為抗原，通過(guò) 3次免疫小鼠，最終獲得滴度高于1∶819 200的抗血清，且特異性較好。Western blot結(jié)果顯示，制備的Trx-His-MpecCu/Zn-SOD抗血清對(duì)大腸桿菌總蛋白中的重組蛋白體進(jìn)行抗體特異性檢測(cè)時(shí)，出現(xiàn)一些雜帶，但目的條帶相對(duì)明顯。Trx-His-MpecCu/Zn-SOD的抗血清能與小胸鱉甲的天然ecCu/Zn-SOD免疫特異性結(jié)合，但不能與黃粉蟲(chóng)的蛋白結(jié)合，表明抗血清具有免疫特異性，為后期進(jìn)行昆蟲(chóng)耐寒性機(jī)制和蛋白功能研究提供重要的免疫檢測(cè)工具。