韓玲， 肖寧， 羅濤， 周江*

(1. 貴州師范大學(xué)，貴陽(yáng)550001； 2. 貴陽(yáng)護(hù)理職業(yè)學(xué)院，貴陽(yáng) 550014)

后棱蛇屬OpisthotropisGünther， 1872隸屬于游蛇科Colubridae，主要分布在中國(guó)南部和東南亞地區(qū)，常見(jiàn)于低山次生林下流速較快的小溪內(nèi)(趙爾宓，2006)。目前，該屬物種有24種，中國(guó)記錄有 14種(Murphyetal.，2008；Caietal.，2015；Renetal.，2017；Wangetal.，2017；Ziegleretal.，2018)，即武陵山系東部的趙氏后棱蛇O.zhaoermiiRen， Wang， Jiang， Guo & Li， 2017、深圳后棱蛇O.shenzhenensisWang， Guo， Liu， Lyu， Wang， Luo， Sun & Zhang， 2017、劉氏后棱蛇O.lauiYang， Sung & Chan， 2013、橫紋后棱蛇O.balteata(Cope， 1895)、莽山后棱蛇O.cheniZhao， 1999、廣西后棱蛇O.guangxiensisZhao， Jiang & Huang， 1978、沙壩后棱蛇O.jacobiAngel & Bourret， 1933、掛墩后棱蛇O.kuatunensisPope， 1928、側(cè)條后棱蛇O.lateralisBoulenger， 1903、山溪后棱蛇O.latouchii(Boulenger， 1899)、香港后棱蛇O.andersonii(Boulenger， 1888)、黃斑后棱蛇O.maculosaStuart & Chuaynkern， 2007、福建后棱蛇O.maxwelliBoulenger， 1914、老撾后棱蛇O.praemaxillaris(Angel， 1929)。貴州省現(xiàn)有記錄的后棱蛇屬物種有側(cè)條后棱蛇和山溪后棱蛇，前者僅分布在湄潭縣，后者廣泛分布于貴州省東部(江口縣、印江縣、石阡縣)、東南部(雷山縣)、南部(貴定縣、荔波縣)等地區(qū)(伍律等，1985；冉輝等，2012；魏剛等，2017)(圖1)。根據(jù)Ren等(2017)對(duì)山溪后棱蛇種組的劃分，山溪后棱蛇與趙氏后棱蛇均屬于山溪后棱蛇種組。

本研究組于2010年8月在貴州省雷公山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)采集到1號(hào)雌性后棱蛇屬成體標(biāo)本；2018年5月在貴州省黃平縣朱家山縣級(jí)自然保護(hù)區(qū)進(jìn)行本底資源調(diào)查時(shí)，共采集到3號(hào)后棱蛇屬物種成體標(biāo)本，其中2號(hào)雌性，另1號(hào)標(biāo)本損壞嚴(yán)重?zé)o法辨別雌雄，無(wú)法進(jìn)行形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)的測(cè)量；2018年5月在貴州省麻江縣進(jìn)行第二次全國(guó)陸生脊椎動(dòng)物調(diào)查時(shí)，采集到1號(hào)雄性后棱蛇屬物種成體標(biāo)本。經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)比較和分子系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定為趙氏后棱蛇，其在貴州的采集(武陵山系以西)，為貴州山溪后棱蛇種組新增一記錄。本研究對(duì)趙氏后棱蛇進(jìn)行了詳細(xì)的形態(tài)學(xué)描述，并補(bǔ)充了武陵山以西此物種的分子生物學(xué)數(shù)據(jù)，以期為理解武陵山系對(duì)爬行動(dòng)物擴(kuò)散作用的生物地理學(xué)意義提供一定的幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料為采自雷公山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)(GZNU320074；108°10′44.49″E，26°22′32.60″N，海拔 1 328 m)、黃平縣朱家山縣級(jí)自然保護(hù)區(qū)(GZNU20180515018、GZNU20180521001、GZNU20-180521002；107°39′44.49″E，26°54′35.23″N，海拔833 m)和麻江縣巖下村(GZNU20180728005；107°37′57.98″E，26°23′49.71″N，海拔759 m)的 5號(hào)趙氏后棱蛇成體標(biāo)本(圖1)。測(cè)量形態(tài)學(xué)性狀后，取尾部肌肉保存于90%乙醇中；標(biāo)本使用10%福爾馬林浸泡，保存于貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動(dòng)物生態(tài)學(xué)標(biāo)本室。

1.2 形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)測(cè)量

標(biāo)本的形態(tài)鑒定參考《中國(guó)蛇類》(趙爾宓，2006)以及Ren等(2017)的檢索表進(jìn)行，對(duì)22個(gè)可量和可數(shù)性狀進(jìn)行了測(cè)量和計(jì)數(shù)。除全長(zhǎng)使用卷尺外，其余指標(biāo)均使用游標(biāo)卡尺測(cè)量。記錄標(biāo)本左側(cè)性狀。測(cè)量指標(biāo)包括：全長(zhǎng)(total length，TL)、尾長(zhǎng)(tail length，TaL)、頭長(zhǎng)(head length，HL)、頭寬(head width，HW)，同時(shí)還參考了Ren等(2017)的方法，對(duì)吻長(zhǎng)(snout length，SL)、吻寬(maximum rostral width，RW)、眼間距(interorbital distance，IOD)、眼徑(eye width，EW)、眼下緣到上唇鱗的距離(distance between the lower margins of eye and of the lip，SOL)、頰鱗的最大長(zhǎng)度(maximum loreal length，LOL)和頰鱗的最大寬度(maximum loreal depth，LOD)、前顳鱗最大長(zhǎng)度(maximum anterior temporal length，TOL)和前顳鱗最大寬度(maximum anterior temporal depth，TOD)進(jìn)行了測(cè)量。標(biāo)本的背鱗(dorsal scale rows，DSR)、上唇鱗(supralabial counts，SL)、下唇鱗(infralabial counts，IL)、顳鱗(temporal counts，TEM)、上頜齒數(shù)(maxillary tooth counts，MT)、腹鱗(ventral counts，VEN)、尾下鱗(subcaudal counts，SC)和眶前鱗(preocular counts，PrO)、眶后鱗(postocular counts，PtO)的可數(shù)性狀鑒定依據(jù)和標(biāo)準(zhǔn)參考趙爾宓(2006)。

除測(cè)量的4號(hào)標(biāo)本外，中國(guó)分布的山溪后棱蛇種組物種的可量及可數(shù)性狀(表2)均來(lái)自相關(guān)文獻(xiàn)(伍律等，1985；趙爾宓，2006；冉輝等，2012；Renetal.，2017)。

1.3 DNA提取、擴(kuò)增和測(cè)序

使用DNeasy Blood & Tissue Kit(No.69504，QIAGEN Catalog)提取肌肉標(biāo)本DNA。選擇線粒體cytb基因作為分子標(biāo)記，使用引物L(fēng)14919(5’-AACCACCGTTGTTATTCAACT-3’)和H16064(5’-CTTTGGTTTACAAGAACAATGCTTTA-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增(Burbrinketal.，2000；Guoetal.，2012)。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 7 min；94 ℃ 40 s，46 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 8 min，4 ℃保存。產(chǎn)物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司雙向測(cè)序。

圖1 貴州省后棱蛇屬物種分布
Fig. 1 Distribution of the genusOpisthotropisin Guizhou province

圓圈表示物種的采集地： 1. 冉輝等(2012)， 2. 魏剛等(2017)， 3. 伍律等(1985)， 4. 本研究， 5. Ren等(2017)； 綠色面狀表示山溪后棱蛇種組的物種在武陵山系、佛頂山以及雷公山區(qū)域的連續(xù)分布

Circles represent where the specimens were collected： 1. Ranetal.， 2012， 2.Weietal.， 2017， 3. Wuetal.， 1985， 4. this study， 5. Renetal.， 2017； green shows the continuous distribution ofOpisthotropislatouchiiandO.zhaoermiiin Wuling Mountains system， Foding Mountains and Leigongshan Mountains

1.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

在NCBI數(shù)據(jù)集對(duì)cytb序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，并使用DAMBE(Xia & Xie，2001)進(jìn)行序列飽和性檢測(cè)。

選擇后棱蛇屬14個(gè)物種的44個(gè)cytb序列(表1)，使用MEGA 7.0(Kumaretal.，2016)的MUSCLE進(jìn)行多重序列比對(duì)，以地理種群分組，采用兩兩對(duì)比方法計(jì)算后棱蛇屬物種間的遺傳距離(p-distances)。

選擇后棱蛇屬14個(gè)物種的44個(gè)cytb序列，緬甸頸槽蛇RhabdophisleonardiWall， 1923和棕網(wǎng)腹鏈蛇HebiusjohannisBoulenger， 1908作為外群(表1)用于系統(tǒng)發(fā)育分析(Renetal.，2017；Wangetal.，2017)。使用貝葉斯法(BI)和最大似然法(ML)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建。最適模型基于赤池信息準(zhǔn)則(AIC)在PartitionFinder 2(Lanfearetal.，2012)進(jìn)行選擇。貝葉斯分析在MrBayes 3.1.2(Ronquist & Huelsenbeck，2003)進(jìn)行，設(shè)置4條鏈獨(dú)立運(yùn)行10 000 000代，每隔100代對(duì)樹(shù)進(jìn)行一次采樣，舍棄前25%，使用貝葉斯后驗(yàn)概率(BPP)檢測(cè)節(jié)點(diǎn)的支持率。在Tracer 1.6 (Rambautetal.，2018)中查看相關(guān)運(yùn)行參數(shù)的收斂性和有效樣本量。在IQ-TREE(Nguyenetal.，2014)中運(yùn)行1 000次Bootstrap重復(fù)抽樣分析，以檢驗(yàn)各節(jié)點(diǎn)置信度，使用BSP值檢驗(yàn)節(jié)點(diǎn)處的支持率。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)鑒定和描述

鑒別特征：頭部與頸部區(qū)分不明顯；前額鱗單枚，寬大于長(zhǎng)；鼻孔向上；眼睛較??；體型呈圓柱形(443.83～532.01 mm)；背鱗通身17行，前部起棱并向后增強(qiáng)；腹鱗138～143枚，尾下鱗二分，57～61對(duì)；無(wú)眶前鱗，眶后鱗2枚或1枚；頰鱗1枚并向后延伸入眶；上唇鱗9～10枚，第5枚與第6枚入眶；體背面和側(cè)面有黑黃相間的縱紋。

形態(tài)描述(圖2，表2)：頭小，略扁平，與頸部區(qū)分不明顯；吻寬而鈍圓，寬大于高；眼較小，瞳孔橢圓形；頭寬大于長(zhǎng)，鼻孔位于鼻鱗靠背中央一邊，鼻間鱗2枚較小，長(zhǎng)大于寬，鼻鱗略偏背側(cè)，鼻孔略近吻背；前額鱗單枚。上唇鱗9枚(4-2-3)或10枚(4-2-4/4-3-3)，第1、2枚與鼻鱗相接，第3枚同時(shí)接鼻鱗和頰鱗；第4枚完全接頰鱗、第5、6枚或第5枚或第6枚或第7枚入眶；下唇鱗9～10枚，第1枚狹長(zhǎng)，前3枚切前頷片；頷片2對(duì)，前頷片稍大于后頷片，后頷片被1～4枚小鱗隔開(kāi)；頰鱗1枚，向后延伸入眶，長(zhǎng)大于寬；無(wú)眶前鱗，眶后鱗1或2枚；前顳鱗1枚(1+1/1+2)。前額鱗正中略呈“∧”形，切入兩鼻間鱗之間，后緣較平；額鱗1枚，呈盾型，后端呈“V”形，與頂鱗相接；頂鱗2枚；背鱗中央起棱，并向后增強(qiáng)，兩側(cè)光滑，背鱗通身17行；腹鱗138～143枚；肛鱗2枚。尾下鱗成對(duì)，57～61對(duì)，尾下鱗的鱗溝呈黑色，在尾腹面中央形成黑色縱線紋。體背面黃褐色，頭背面略深，隱約有不規(guī)則黑色斑，體背面及側(cè)面有黑色與黃色細(xì)長(zhǎng)縱線相間排列，中央2條黃色縱紋在體前端顏色較深，向后逐漸變淡；腹部淺黃色，外側(cè)有不對(duì)稱點(diǎn)斑。

采自貴州省的5號(hào)后棱蛇屬標(biāo)本形態(tài)特征符合Ren等(2017)趙氏后棱蛇模式產(chǎn)地標(biāo)本形態(tài)特征的描述。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

將5號(hào)趙氏后棱蛇標(biāo)本的cytb序列上傳到GenBank后，將后棱蛇屬14個(gè)物種的cytb序列進(jìn)行比對(duì)和編輯后，確定用于分析的序列長(zhǎng)度為1 060 bp，其中有623個(gè)保守位點(diǎn)、437個(gè)變異位點(diǎn)和400個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)。

5號(hào)趙氏后棱蛇與模式產(chǎn)地的趙氏后棱蛇之間的遺傳距離為0.08%；后棱蛇屬物種間的遺傳距離差異較大，為5.05%～17.65%；5號(hào)趙氏后棱蛇與山溪后棱蛇和莽山后棱蛇的遺傳距離較近，分別為5.14%和5.57%。

基于BI法和ML法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)產(chǎn)生了相同的的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，僅在末端分支節(jié)點(diǎn)上存在一些差異。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示，5號(hào)趙氏后棱蛇與模式產(chǎn)地的趙氏后棱蛇聚為一支(BPP=1.00，BSP=100)；趙氏后棱蛇與莽山后棱蛇和山溪后棱蛇聚為一支，符合山溪后棱蛇種組的劃分(Renetal.，2017)(圖3)。

遺傳距離和系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，采自貴州省雷山縣、黃平縣和麻江縣的后棱蛇屬物種標(biāo)本為趙氏后棱蛇。

2.3 生境描述

貴州省黃平縣和麻江縣采集的趙氏后棱蛇主要分布在海拔833～900 m的溪流及附近地區(qū)，溪流湍急，水溫18 ℃，溪流兩側(cè)灌叢-雜草叢茂盛；也偶見(jiàn)于農(nóng)用水渠中，見(jiàn)光即迅速竄入水溪流的泥沙中。雷山縣采集的趙氏后棱蛇分布在海拔1 328 m的溪流附近。

3 討論

基于形態(tài)學(xué)比較和系統(tǒng)發(fā)育分析，證實(shí)了采自武陵山系以西的雷公山地區(qū)(貴州省雷山縣)和佛頂山地區(qū)(貴州省黃平縣、麻江縣)的后棱蛇屬物種為趙氏后棱蛇，屬于山溪后棱蛇種組(Renetal.，2017)。

與山溪后棱蛇種組物種在武陵山系、佛頂山和雷公山區(qū)域的連續(xù)分布不同，側(cè)條后棱蛇在貴州分布具有局限性。趙氏后棱蛇在貴州的發(fā)現(xiàn)表明，長(zhǎng)江流域-武陵山系的物種多樣性可能被低估，因?yàn)樵谶@一地理單元已有多個(gè)兩棲爬行類新種被描述(徐寧等，2007；李松等，2008a，2008b，2010；Yangetal.，2011；王超等，2013；Wangetal.，2013；Zhangetal.，2017)，這可能是該地區(qū)在第四紀(jì)冰川冰期作為避難所的緣故，因?yàn)樵谶@一地區(qū)分布著第四紀(jì)冰川的孑遺動(dòng)植物，如：黔金絲猴Rhinopithecusbrelichi、珙桐Davidiainvolucrata與銀杏Ginkgobiloba(貴州省黔東南苗族侗族自治州人民政府，1989；貴州省林業(yè)廳，梵凈山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)，1990)。同時(shí)，采自貴州省雷山縣的樣本(GZNU320074)最先分化出來(lái)，這表明該種的擴(kuò)散中心可能位于苗嶺地區(qū)，并沿著武陵山系向東側(cè)擴(kuò)散而形成現(xiàn)有分布格局。本研究分析得知，武陵山以東的(湖南省古丈縣)和以西(貴州省佛頂山地區(qū))的趙氏后棱蛇種群之間的遺傳距離為0.08%，這表明武陵山系的抬升對(duì)周圍地區(qū)物種的不同地理種群之間的基因交流可能存在地理屏障作用(Zhongetal.，2015；Guoetal.，2016；李仕澤等，2016)。武陵山系的存在和抬升對(duì)趙氏后棱蛇遷移和擴(kuò)散所形成的生物地理屏障較弱，這可能是由于武陵山系的造山運(yùn)動(dòng)和苗嶺抬升的時(shí)間較晚(周啟泳，陳佩英，1993)。對(duì)于武陵山系周圍地區(qū)形成這一生物地理分布格局的原因仍有待進(jìn)一步使用生物地理學(xué)方法進(jìn)行研究。

表1 GenBank中下載用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的cyt b序列信息Table 1 Summary of cyt b sequences used for reconstructing the phylogenetic tree

圖2 貴州省3個(gè)縣分布的趙氏后棱蛇雌性成體標(biāo)本
Fig. 2 Adult females ofOpisthotropiszhaoermiicollected in Guizhou province

黃平縣標(biāo)本(GZNU20180521002)背面(A)和腹面(B)； 雷山縣標(biāo)本(GZNU320074，A1～A3)、麻江縣標(biāo)本(GZNU20180728005，B1～B3)和黃平縣標(biāo)本(GZNU20180521001， C1～C3和GZNU20180521002， D1～D3)； 頭側(cè)面(A1、B1、C1、D1)、頭背面(A2、B2、C2、D2)和頭腹面(A3、B3、C3、D3)

Dorsal (A) and ventral (B) views of GZNU20180521002 collected in Huangping county； lateral， dorsal and ventral views of the specimens from Leishan county (GZNU320074， A1-A3)， Majiang county (GZNU20180728005， B1-B3) and Huangping county (GZNU20180521001， C1-C3 and GZNU20180521002， D1-D3)

圖3 基于線粒體cyt b序列構(gòu)建的后棱蛇屬的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 3 Phylogenetic tree constructed based on the cyt b sequences of genus Opisthotropis

節(jié)點(diǎn)數(shù)字表示主要分支的BPP/BSP值， 加粗編號(hào)為本研究中采集到的標(biāo)本編號(hào)

The number at the node represents the BPP/BSP value， the numbers in bold represent the number of specimens collected in this study

伍律等(1985)記錄了貴州省分布的山溪后棱蛇的形態(tài)數(shù)據(jù)，冉輝等(2012)和魏剛等(2017)分別記錄了采自貴州佛頂山和梵凈山地區(qū)的山溪后棱蛇標(biāo)本，其物種描述部分和圖片均與采自貴州省的趙氏后棱蛇相似，但是物種描述不詳細(xì)，且缺乏分子生物學(xué)證據(jù)，不能肯定是否為山溪后棱蛇，需要重新檢視標(biāo)本，因此在今后的分類學(xué)研究工作中，不僅需要使用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法，還需要結(jié)合分子遺傳學(xué)方法。

致謝：感謝中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所任金龍?jiān)跇?biāo)本鑒定方面提供的幫助，感謝貴州省林業(yè)科學(xué)研究院、雷公山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)、黃平縣朱家山縣級(jí)自然保護(hù)區(qū)和工作人員在調(diào)查過(guò)程中提供的幫助，感謝周俊、崔洪濤、曾祥和范祥迪在樣品采集及測(cè)量中的幫助。