申順先 李學慧 梁明勤

摘要：以丹參葉片為外植體，利用正交試驗等方法篩選優(yōu)化丹參葉片不定芽誘導、不定芽叢增殖及壯苗生根、不定根毛狀根誘導的適宜方案。結果表明：適宜葉片不定芽誘導的配方是MS+0.5 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+瓊脂 6.5 g/L;不定芽叢增殖的最適配方是2/3 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L GA3+30 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂，平均芽增殖系數達12.00;適宜幼苗產生根的配方是1/2 MS+0.05 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L IBA+20 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂，生根率達100%;適宜葉片誘導不定根毛狀根的配方是MS+0.5 mg/L 2，4-D+30 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂。

關鍵詞：丹參;葉片離體培養(yǎng);不定芽;毛狀根

中圖分類號： S567.5+30.43? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）12-0070-04

丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge）為唇形科鼠尾草屬的多年生草本植物，以根和根莖入藥[1]，能活血祛瘀，養(yǎng)血安神，具有擴張血管、降脂、降壓從而改善微循環(huán)等作用，現常用于心、腦血管等疾病的治療和保健預防[2]，是我國十分重要的中藥材。然而由于丹參產地較多[3-4]，加上其為常異花授粉植物[5-6]，種子繁殖中的天然異交引起一定的種性變異，分根或蘆頭繁殖易攜帶病菌引起種性退化[7]，導致丹參原藥質量不一，甚至影響臨床療效。丹參組織培養(yǎng)技術既可以獲得種性一致的脫毒種苗加快優(yōu)質種苗的繁殖速度[8]，又可以通過愈傷組織及毛狀根進行藥物有效成分的生產[9-10]，從而避免品種混亂導致藥效下降，為生產大量“血統(tǒng)純正”的丹參原藥奠定基礎。本試驗以丹參無菌葉片為外植體從不定芽誘導、不定芽叢增殖培養(yǎng)、不定根及毛狀根誘導培養(yǎng)等方面進行探索，建立并優(yōu)化了丹參葉片離體培養(yǎng)體系，為丹參優(yōu)質種苗工廠化生產及毛狀根培養(yǎng)提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為無菌丹參葉片，取自2014年初代培養(yǎng)獲得的紫花丹參無菌組培苗。

1.2 試驗方法

1.2.1 葉片誘導培養(yǎng) 2015年10月至2016年1月期間，采用預先培養(yǎng)在MS+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂培養(yǎng)基（pH值6.0，下同）上的旺盛生長、健壯一致的丹參無菌綠苗，取寬 1.5～2.0 cm平展、健康帶葉柄的葉片，從中間主脈附近縱向一剪為二， 接種在MS+30 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂為基本培養(yǎng)基附加不同濃度6-BA、2，4-D的培養(yǎng)基進行誘導培養(yǎng)，初步探索葉片離體培養(yǎng)誘導培養(yǎng)基配方。培養(yǎng)條件（下同）為溫度（25±2） ℃，光照強度3 000 lx，每天光照10 h，培養(yǎng)室空氣相對濕度70%。第3周統(tǒng)計愈傷組織誘導率，第6周統(tǒng)計不定芽（根）分化率[11]，具體計算公式如下：

愈傷組織誘導率=（產生愈傷組織的葉片塊數/接種的葉片塊數）×100%;

不定芽（根）分化率=[產生不定芽（根）的葉片塊數/接種的葉片塊數]×100%。

1.2.2 不定芽叢增殖配方的篩選 2016年5月，以MS培養(yǎng)基的微量鐵鹽和有機物為培養(yǎng)基基本成分（附加瓊脂 6.5 g/L），對MS大量元素、6-BA、NAA、GA3和蔗糖濃度進行5因素4水平正交試驗（表1）。采用預先在MS+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)4周的旺盛生長、健壯一致的丹參無菌綠苗，取寬1.5～2.0 cm平展、健康帶葉柄的葉片，從中間主脈附近縱向一剪（并不分開），正面向上接種于16個培養(yǎng)基配方上培養(yǎng)，每個配方接種4瓶，每瓶接種4張葉片。6周后統(tǒng)計不定芽叢增殖系數，計算公式如下：

不定芽叢增殖系數=有效芽苗數/接種葉片數，注意有效芽苗是指苗高不低于0.5 cm的芽苗。

1.3 數據分析

各項平均值、方差分析采用Microsoft Office Excel軟件進行。

2 結果與分析

2.1 葉片誘導培養(yǎng)配方的篩選

2.1.1 葉片誘導培養(yǎng)中6-BA對不定芽產生的影響 丹參無菌葉片在附加不同濃度6-BA的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，除 6-BA 濃度為0的配方外，大都在1周前后啟動細胞分裂，1～2周形成愈傷組織，2～3周出現綠色芽體，3周后愈傷組織不再明顯增長，不定芽分化明顯。由表2可知，不附加生長調節(jié)物質的基本培養(yǎng)基MS不能誘導丹參葉片產生愈傷組織，更不會出現不定芽的分化。當僅附加適當濃度的6-BA時就能誘導葉片切口處產生愈傷組織，并分化出不定芽;但愈傷組織誘導率與不定芽分化率卻隨著6-BA濃度的增高反而降低。因此，丹參葉片誘導不定芽以采用配方MS+0.5 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂為好（圖1-A）。

試驗中還發(fā)現，在葉柄切口處也易產生愈傷組織，并進一步分化出不定芽，但當葉柄插入培養(yǎng)基內部時卻很難產生;當葉片正面向下背面向上放在培養(yǎng)基上時，也很難產生愈傷組織。此外，有的芽不經愈傷組織階段而直接產生于葉片上。

2.1.2 葉片誘導培養(yǎng)中2，4-D對不定根及毛狀根產生的影響 丹參無菌葉片在附加不同濃度2，4-D的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，除2，4-D濃度為0的配方外，大都能在葉片、葉柄切口處產生愈傷組織，并進行根的分化產生根突，快的3周內就已經產生大量的根。由表3可知，不附加生長調節(jié)物質的MS不能誘導丹參葉片出現不定根的分化;當僅附加適當濃度的2，4-D時就能誘導葉片產生愈傷組織，并分化出不定根;但不定根分化率卻隨著2，4-D濃度的增高反而降低。說明2，4-D可以誘導丹參葉片產生愈傷組織并分化出不定根，但當2，4-D濃度過高時抑制不定根的分化?？梢姡⑷~片誘導不定根以附加2，4-D 0.1～0.5 mg/L為佳。試驗中發(fā)現當2，4-D濃度升高至0.25 mg/L及其以上時會分化出毛（發(fā)）狀根，0.50 mg/L時能產生大量毛（發(fā)）狀根（圖1-B）。因此，適宜丹參葉片誘導不定根毛狀根的配方是MS+0.5 mg/L 2，4-D+30 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂。

綜合以上試驗表明，6-BA與2，4-D都能使丹參葉片發(fā)生脫分化產生愈傷組織，但6-BA會促使愈傷組織進一步分化為不定芽，而 2，4-D會促使愈傷組織進一步分化為不

2.2 不定芽叢增殖培養(yǎng)基配方篩選與優(yōu)化

2.2.1 不定芽叢增殖培養(yǎng)正交試驗結果分析 第2周，培養(yǎng)在16個配方上的丹參葉片均已產生淡綠色粒狀松散愈傷組織，愈傷組織主要產生于葉片及葉柄切口與培養(yǎng)基接觸部位;配方1、2、5、7、9、14、15上的愈傷組織出現綠色芽點。第4周，除配方4、8、12、16上愈傷組織剛開始或正在分化芽外，其他配方均已產生不定芽;此外，配方1、4、10、13上均有一塊愈傷組織產生了1或2條根。第6周，丹參葉片不定芽叢增殖系數和生長狀況見表4，可見丹參不定芽分化率除配方4為75%外，其他配方均達100%;除配方4、8外，其他配方都或多或少地分化出了不定芽叢;增殖系數除配方3、4、8、12、13、16外，其他配方均不低于10.00倍;增殖系數最高的是配方6，達12.00倍，次之的是配方7，達11.75倍;增殖系數最低的是配方4，僅為3.56倍。對不定芽叢增殖系數高低的影響效應由主到次的排序是6-BA、MS大量元素、NAA、GA3、蔗糖（方差分析表明，6-BA、MS大量元素、NAA濃度均差異極顯著，GA3、蔗糖濃度差異顯著），五者引起平均芽增殖系數最高的水平分別是第2、2、1、1、2水平，即丹參葉片不定芽叢增殖比較適宜的配方是2/3 MS+0.5 mg/L 6-BA+25 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂。

2.2.2 不定芽叢增殖培養(yǎng)基配方對比試驗結果分析 因正交試驗篩選的適宜配方并不在16個配方中，故將該配方與正交試驗中增殖系數最高的6號配方、次高的7號配方等同時接種，進行對比試驗（表5，各配方附加瓊脂6.5 g/L）。6周后對比試驗結果表明，此配方的增殖系數（9.56）明顯低于原6號配方（11.85）與原7號配方（11.90）。綜合正交試驗、對比試驗結果，并兼顧不定芽苗的健壯程度，認為丹參葉片不定芽叢增殖最適的培養(yǎng)基配方是原6號配方，即2/3 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L GA3+30 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂（圖1-C）。

2.3 壯苗與生根培養(yǎng)

經丹參葉片離體培養(yǎng)產生的不定芽叢，苗高并不整齊，有的苗較大且健壯，有的苗較小且弱。對于健壯大苗，可以分切后直接接種在生根培養(yǎng)基上誘導生根。對于較小弱苗，可以分切后先接種在MS培養(yǎng)基上進行壯苗培養(yǎng)，待苗長高后可以再轉接在生根培養(yǎng)基上誘導生根。生根培養(yǎng)接種于培養(yǎng)基1/2 MS+0.05 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L IBA+20 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂，1周前后就產生白色根，2周生根率達100%（圖1-D）。

表5 不定芽叢增殖培養(yǎng)對比試驗結果

配方???????? 增殖系數???????? 不定芽叢生長狀況

2/3 MS+0.5 mg/L 6-BA+25 g/L蔗糖??????? 9.65 綠色不定芽叢，有的苗較高，但不整齊

2/3 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L GA3+30 g/L蔗糖??????? 11.85??????? 綠色不定芽叢，苗高與上者持平，也不整齊

2/3 MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+25 g/L蔗糖??????? 11.90??????? 綠色不定芽叢，苗高不整齊，較多芽小而密，輕度玻璃化

3 討論與結論

誘導丹參葉片、葉柄、花蕾等不含芽材料脫分化，經器官發(fā)生方式再分化出完整植株是比較容易實現的[12-14]，但要將其作為丹參種苗生產途徑就需要解決關鍵問題，即不定芽叢增殖最適培養(yǎng)基配方的獲得。為了實現這個目的，本研究采用正交試驗等方法從基本培養(yǎng)基大量元素與多種生長調節(jié)劑濃度組配著手，篩選并優(yōu)化了丹參葉片不定芽叢增殖培養(yǎng)基配方。

丹參不定芽叢增殖正交試驗中，MS基本培養(yǎng)基大量元素濃度差異極顯著，在2/3 MS時更有利于不定芽叢的增殖。誘導試驗中，丹參葉片在MS基本培養(yǎng)基上（無任何生長調節(jié)劑），既不會產生愈傷組織也不會產生不定芽和根，在添加0.5 mg/L 6-BA時，3周愈傷組織誘導率與6周不定芽分化率都達到了100%，然而這2個指標卻隨著6-BA濃度的進一步增高（0.5→1.5 mg/L）反而降低。正交試驗中，6-BA濃度差異極顯著，在第2周、第4周、第6周的動態(tài)觀察中發(fā)現了有類似的現象，在6-BA濃度由0.25增至0.50 mg/L時平均芽增殖系數也隨著增大，而由0.50增至1.00 mg/L時開始減小，再增至2.00 mg/L時明顯減小，6-BA濃度均為 2.00 mg/L 的配方4、8、12、16愈傷組織分化不定芽反而較慢;這說明低濃度的6-BA會促進芽的分化，而高濃度反而有一定的抑制作用。NAA濃度差異極顯著，平均芽增殖系數隨著NAA濃度的增高反而減小，這說明NAA對分化芽有一定的抑制作用。這些現象與梁紅等[11]、解曉紅等[15]、蔡朝暉等[16]的發(fā)現是一致的。結合丹參葉片誘導試驗、正交試驗、對比試驗的篩選與優(yōu)化結果，丹參葉片誘導不定芽叢增殖最適配方是2/3 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L GA3+30 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂，其可以次序有效地誘導出愈傷組織與不定芽叢，甚至直接誘導出不定芽叢，增殖系數達12.00倍。增殖培養(yǎng)產生的不定芽苗，經壯苗培養(yǎng)后轉接在生根培養(yǎng)基1/2 MS+0.05 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L IBA+20 g/L 蔗糖+7 g/L瓊脂上，1周前后就產生白色根，2周生根率達100%。

誘導丹參毛狀根培養(yǎng)系統(tǒng)逐漸成為生產丹參藥理活性物質的良好體系[17]，而大多數研究者是利用發(fā)根農桿菌轉化丹參外植體誘導毛狀根的[18-19]，不僅需菌株培養(yǎng)、外植體侵染，而且成功后還要多次轉接進行除菌培養(yǎng)，費時費力;就不如本研究通過2，4-D直接誘導葉片產生毛狀根更便利。本研究發(fā)現，MS附加2，4-D 0.1～0.5 mg/L適宜誘導丹參葉片產生愈傷組織并分化出不定根，當2，4-D濃度升高至 0.25 mg/L 及其以上時分化出不定根毛狀根，0.50 mg/L時產生大量毛狀根，但當2，4-D濃度過高時卻抑制不定根的分化;MS+0.5 mg/L 2，4-D+30 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂就是丹參葉片誘導不定根毛狀根的適宜配方，無疑這為利用毛狀根培養(yǎng)生產丹參活性成分開辟了一條新途徑。

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