張 婧，貢松松，吳劍平，潘 娟，王 博，嚴(yán) 鳳

(上海市獸藥飼料檢測(cè)所，上海 201103)

現(xiàn)代畜牧養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展離不開(kāi)抗生素。獸用抗生素的合理使用可以預(yù)防、治療動(dòng)物疾病，促進(jìn)和維持動(dòng)物的健康生長(zhǎng)[1]。但一些不法商販?zhǔn)芙?jīng)濟(jì)利益驅(qū)使，在飼料中蓄意添加禁用抗生素等風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)，不僅影響畜禽的正常生長(zhǎng)，而且給畜禽產(chǎn)品質(zhì)量帶來(lái)了安全隱患[2]。多年來(lái)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部一直強(qiáng)調(diào)建立以質(zhì)量安全為核心的飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)體系，強(qiáng)化飼料獸藥等投入品的風(fēng)險(xiǎn)管控，提升畜產(chǎn)品質(zhì)量安全的保障能力。自2002年起陸續(xù)頒布了農(nóng)業(yè)部第176號(hào)公告《禁止在飼料和動(dòng)物飲用水中使用的藥物品種目錄》，第193號(hào)公告《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其它化合物清單》以及第1519號(hào)公告《禁止在飼料和動(dòng)物飲水中使用的物質(zhì)》等[3-5]。因此，各類(lèi)公告中禁止或限量使用的各種抗生素及其他化合物的檢測(cè)一直是畜產(chǎn)品質(zhì)量安全的重要保障。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

乙腈、甲醇(色譜純，美國(guó)Merck 公司)；甲酸(色譜純，美國(guó)Tedia公司)；實(shí)驗(yàn)用水為超純水(Milli-Q超純水系統(tǒng)自制)。

74種抗生素及其他化合物的標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司、德國(guó)Witega公司、美國(guó)Sigma公司、中國(guó)藥品生物制品檢定所、中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所和天津阿爾塔有限公司。標(biāo)準(zhǔn)品純度為88.6%～99.8%，相關(guān)信息如表1所示。

Q-Exactive四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜配H-ESI Ⅱ 源、Ultimate 3000液相色譜系統(tǒng)及Trace Finder數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取10 mg標(biāo)準(zhǔn)品(根據(jù)純度折算質(zhì)量)，用甲醇或50%乙腈等合適的溶劑溶解并定容至10 mL，制成1 mg/mL的單標(biāo)儲(chǔ)備液。對(duì)于每類(lèi)化合物，將單標(biāo)溶液混合配制成50 μg/mL或100 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用時(shí)再根據(jù)需要混合或稀釋。所有標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液均置于4 ℃下避光保存。

1.3 儀器條件

1.3.1 液相色譜條件色譜柱:Agilent SB C18柱(3.0 mm×100 mm，1.8 μm),流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸乙腈溶液。梯度洗脫程序：0～15.0 min，5%～95%B；15.0～17.0 min，95%B；17.0～17.5 min，95%～5%B；17.5～21.0 min，5%B；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件可加熱的電噴霧離子源(HESI-Ⅱ)，離子傳輸管溫度：325 ℃，毛細(xì)管電壓：3 200 V(正、負(fù)離子切換模式)，氣化溫度：350 ℃，鞘氣(N2)：40 L/min，輔助氣(N2)：10 L/min，一級(jí)質(zhì)譜駐留時(shí)間：100 ms，二級(jí)質(zhì)譜駐留時(shí)間：50 ms，一級(jí)全掃描范圍：m/z100～1 200，分辨率(R)：70 000，掃描模式：Full scan+dd MS2，碰撞裂解氣：高純氮?dú)?，碰撞能量?0、40、60 eV。母離子及子離子的精確分子量見(jiàn)表1。

1.4 樣品前處理

豬尿樣品經(jīng)9 000 r/min離心3 min后，精密移取200 μL，用0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液(95∶5，體積比)稀釋至1 mL，待測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理方法的優(yōu)化

待測(cè)藥物種類(lèi)多，且各藥物的理化特性各異。因此，樣品前處理方法需具有普適性，且盡量簡(jiǎn)化前處理步驟，以減少目標(biāo)化合物的損失。PRiME HLB和EMR-Lipid固相萃取法均為通過(guò)式固相萃取法，萃取柱無(wú)需活化和平衡，樣品凈化過(guò)程簡(jiǎn)單、快速、有效，近幾年被逐漸應(yīng)用于獸藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域[21-22]。由于尿樣基質(zhì)相對(duì)簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)對(duì)比了直接稀釋法、乙腈提取后經(jīng)PRiME HLB固相萃取和EMR-Lipid固相萃取3種前處理方法。其中，直接稀釋法是將樣品經(jīng)高速離心后直接用初始流動(dòng)相稀釋5倍進(jìn)樣分析。后兩種固相萃取法是取2 mL尿樣加入18 mL乙腈提取，過(guò)PRiME HLB(3 mL)或EMR-Lipid(3 mL)固相萃取柱后，取1 mL以氮?dú)獯蹈?，?.5 mL初始流動(dòng)相復(fù)溶后上機(jī)測(cè)定。結(jié)果表明，直接稀釋法對(duì)74種藥物的提取效果最好，尤其是對(duì)四環(huán)素類(lèi)及喹諾酮類(lèi)藥物提取時(shí)損失很小。因此，選用直接稀釋法對(duì)豬尿樣品進(jìn)行前處理。同時(shí)，為減少藥物過(guò)濾膜時(shí)的損失，樣品經(jīng)高速離心并稀釋后直接進(jìn)樣。

2.2 篩查與確證方法研究

根據(jù)歐盟法規(guī)2002/657/EC[23]，以識(shí)別分(IPs)為指標(biāo)對(duì)化合物進(jìn)行定性分析，對(duì)于不同法規(guī)要求的殘留物，確證所需的IPs各不相同。確證指令96/23/EC[24]附錄I-A組所列的物質(zhì)(即違禁化合物)，最少需要4個(gè)識(shí)別點(diǎn)；確證附錄I-B組所列的物質(zhì)(即限用化合物)，最少需要3個(gè)識(shí)別點(diǎn)。不同質(zhì)譜技術(shù)的IPs亦各不相同，針對(duì)高分辨質(zhì)譜(分辨率大于10 000)，需要1個(gè)母離子與1個(gè)子離子即可滿足4個(gè)識(shí)別點(diǎn)，其中1個(gè)母離子為2.0 IPs，對(duì)應(yīng)的1個(gè)子離子為2.5 IPs。此外，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)陸續(xù)發(fā)布了關(guān)于獸藥殘留檢測(cè)的指導(dǎo)準(zhǔn)則FDA-CVM GFI #118號(hào)法規(guī)[25]，針對(duì)獸藥殘留的篩查確證指南[26]，以及關(guān)于食品和飼料中農(nóng)藥殘留分析的質(zhì)量控制和方法驗(yàn)證程序?qū)tFDA-SANTE/11813/2017[27]。其中對(duì)精確質(zhì)量數(shù)偏差作出了規(guī)定，確證條件為至少需要1對(duì)合適的母離子與子離子，母離子的精確質(zhì)量數(shù)偏差≤5 ppm，子離子的精確質(zhì)量數(shù)偏差≤10 ppm。

按照上述原則和儀器方法，對(duì)目標(biāo)藥物單標(biāo)溶液進(jìn)樣測(cè)定并建庫(kù)分析，獲得母離子的精確質(zhì)量數(shù)、保留時(shí)間及其二級(jí)碎片離子的全掃描圖譜，找出豐度最高的子離子和母離子作為確證所需的定性離子對(duì)。以74種藥物的保留時(shí)間、母離子及子離子的精確質(zhì)量數(shù)作為定性依據(jù)，具體見(jiàn)表1。

表1 74種目標(biāo)藥物的保留時(shí)間(RT)、母離子及子離子的精確質(zhì)量數(shù)Table 1 Retention times(RT),parent ions and fragment informations of 74 targeted compounds

(續(xù)表1)

No.CategoryChinesenameEnglishnameRT(min)Parention(m/z)Fragment1(m/z)Fragment2(m/z)Fragment3(m/z)18磺胺硝苯Sulfanitran9.33336.06487294.05430198.02194156.0113719磺胺苯吡唑Sulfaphenazole8.42315.09102222.03317158.07127108.0443920磺胺吡啶Sulfapyridine5.24250.06447184.08692156.01138108.0443921磺胺喹啉Sulfaquinoxaline8.22301.07537156.01138108.0443992.0494822磺胺噻唑Sulfathiazole5.11256.02089156.01138108.0443992.0494823磺胺二甲基異嘧啶Sulfisomidine4.25279.09102156.01138124.08692108.0443924磺胺異唑Sulfisoxazole7.61268.07504156.01138113.07094108.0443925甲氧芐啶Trimethoprim4.98291.14517275.11387261.09822245.1033026Tetracyclines4-差向脫水四環(huán)素4-Epianhydrotetracycline7.10427.1499898.06004239.07030321.0757027(四環(huán)素類(lèi),8種)4-差向四環(huán)素鹽酸鹽4-Epitetracyclinehydrochloride5.10445.16054410.12343201.0910198.0600428金霉素Chlortetracycline6.60479.12157462.09502444.08446154.0498729去甲基金霉素Demeclocyclin5.59465.10592448.07937430.06881154.0498730多西環(huán)素Doxycycline6.32445.16054428.13399321.07575267.0651831土霉素Oxytetracycline5.15461.15546426.11834337.07066283.0601032四環(huán)素Tetracycline5.50445.16054410.12343154.0498798.0600433美他環(huán)素Methacycline6.56443.14489426.11834201.05462-34Quinolones西諾沙星Cinoxacin7.27263.06625235.07133217.06077207.0400335(喹諾酮類(lèi),15種)環(huán)丙沙星Ciprofloxacin5.17332.14050288.15067245.10847231.0928236達(dá)氟沙星Danofloxacin5.00358.15615314.16632283.12412257.1075037雙氟沙星Difloxacin5.70400.14672356.15689299.09905-38依諾沙星Enoxacin4.60321.13575277.14592257.13969234.1037239恩諾沙星Enrofloxacin5.66360.17180316.18197245.10847203.0615040氟羅沙星Fleroxacin4.80370.13730326.14747269.08962-41氟甲喹Flumequine9.40262.08740244.07683220.04045-42洛美沙星Lomefloxacin5.00352.14672308.15690265.11470251.0990543麻保沙星Marbofloxacin4.60363.14631320.1041172.08078-44萘啶酸Nalidixicacid9.22233.09207205.06077187.05020-45諾氟沙星Norfloxacin4.70320.14050276.15067233.10847256.1444446氧氟沙星Ofloxacin4.80362.15106318.16123261.10338-47培氟沙星Pefloxacin4.80334.15615290.16632233.10847-48沙拉沙星Sarafloxacin6.20386.13107342.14030299.09810322.1333049Macrolide交沙霉素Josamycin8.92828.47400174.11247109.06479600.3378450(大環(huán)內(nèi)酯類(lèi),6種)吉他霉素Kitasamycin8.60786.46343558.32727174.11247109.0647951替米考星Tilmicosin6.20869.57332174.1124788.07569126.1274052羅紅霉素Roxithromycin9.10837.53185679.43755158.11756116.1069953泰妙菌素Tiamulin9.00494.32986192.10528119.01613-54泰樂(lè)菌素Tylosin7.50916.52643772.44778174.1124788.0756955Lincosamides林可霉素Lincomycin4.00407.22103126.12773359.21766-56(林可胺類(lèi),2種)克林霉素Clindamycin6.00425.18715126.12772377.18378-57Chloramphenicols氟苯尼考Florfenicol7.40355.99319335.98696185.02779119.0502458(氯霉素類(lèi),3種)甲砜霉素Thiamphenicol5.70353.99752290.02593185.02779119.0502459氯霉素Chloramphenicol7.60321.00505257.03346194.04588176.0353260β-Lactam阿莫西林Amoxicillin3.58366.11182208.04267134.06004114.0008161(β-內(nèi)酰胺類(lèi),2種)苯唑西林Oxacillin9.76402.11182243.07642160.04268144.0443962Nitroimidazoles甲硝唑Metronidazole4.24172.07167128.0454582.02874-63(硝基咪唑類(lèi),2種)羥基甲硝唑Metronidazole-hydroxy3.70188.06658144.04037126.02980123.0552964Benzimidazoles阿苯達(dá)唑Albendazole7.90266.09577234.06956191.01478159.0427165(苯并咪唑類(lèi),7種)阿苯達(dá)唑亞砜Albendazolesulfoxide5.82282.09069240.04374208.01752191.0147866奧吩達(dá)唑Oxfendazole6.80316.07504284.04882223.05760191.0325467氟苯達(dá)唑Flubendazole8.70314.09355282.06733123.02470-682-氨基氟苯咪唑2-Amino-flubendazole6.60256.08807123.02407113.03972133.0634569甲苯達(dá)唑Mebendazole8.30296.10297264.07675105.0334995.0491470噻苯達(dá)唑Thiabendazole4.40202.04334175.03244131.06037-71Quinoxalines(喹啉類(lèi),4種)3-甲基喹啉-2-羥酸3-Methyl-quinoxaline-2-carboxylicacid6.63189.06585145.07602118.0651392.0494872乙酰甲喹Mequindox6.00219.07642143.06037185.07094160.0631173喹乙醇Olaquindox3.82264.09788246.08732202.06110177.0658574喹烯酮Quinocetone9.77307.10772103.05423131.04941143.06037

*no data

2.3 方法的線性關(guān)系

高分辨質(zhì)譜可以提供待測(cè)組分可能的元素組成，僅需采用全掃描并提取精確質(zhì)量數(shù)色譜圖即可完成定性定量，利用自動(dòng)觸發(fā)的二級(jí)質(zhì)譜采集完成準(zhǔn)確定性[28]。因此，在檢出限濃度下，只要保證多種藥物能夠全部檢出并能準(zhǔn)確定性即可，樣品基質(zhì)效應(yīng)基本可以忽略。本實(shí)驗(yàn)采用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線法或單點(diǎn)法進(jìn)行定性定量。

將混合標(biāo)準(zhǔn)中間液用初始流動(dòng)相稀釋成質(zhì)量濃度為2、5、10、20、50、100、500、1 000、2 000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液，按照本方法進(jìn)行檢測(cè)，以待測(cè)物的分子離子峰面積對(duì)其質(zhì)量濃度(ng/mL)進(jìn)行線性回歸，獲得各目標(biāo)化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,74種化合物在各自區(qū)間內(nèi)線性良好,相關(guān)系數(shù)r2>0.99(見(jiàn)表2)。

表2 74種目標(biāo)藥物的相關(guān)系數(shù)、線性范圍及在檢出限加標(biāo)濃度下的回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)Table 2 Correlation coefficients,linear ranges,recoveries and relative standard deviations(RSD) at LOD spiked level of 74 targeted compounds

(續(xù)表2)

Compoundr2Linearrange(ng/mL)Recovery(%)RSD(%)Sarafloxacin0.99812～50066.68.0Sulfabenzamide0.99672～100084.96.9Sulfacetamide0.99682～50098.115Sulfachloropyridazine0.99922～100074.411Sulfadiazine0.99762～10001029.0Sulfadimethoxine0.99822～100099.65.1Sulfadoxine0.99942～100090.011Sulfaguanidine0.99902～50039.811Sulfalen0.99942～100086.020Sulfamerazine0.99872～10001459.4Sulfameter0.99652～100064.720Sulfamethazine0.99922～100011210Sulfamethizole0.99912～100065.812Sulfamethoxazole0.99932～100065.36.4Sulfamethoxypyridazine0.99532～100084.02.6Sulfamonomethoxine0.99902～10001157.9Sulfamoxol0.99752～10001193.7Sulfanitran0.99782～100076.15.9Sulfaphenazole0.99852～10001084.9Sulfapyridine0.99762～100095.84.4Sulfaquinoxaline0.99862～100087.84.9Sulfathiazole0.99602～10001234.9Sulfisomidine0.99512～2001205.0Sulfisoxazole0.99912～100075.45.4Tetracycline0.99142～5001068.3Thiabendazole0.99622～20075.29.2Thiamphenicol0.99052～5069.413Tiamulin0.99752～100071.19.2Tilmicosin0.99065～50066.021Trimethoprim0.99232～10063.79.4Tylosin0.99342～100091.59.0

2.4 假陰性率與檢出限

根據(jù)FDA-SANTE/11813/2017,定性篩選法的檢出限是在至少95%的樣品中檢測(cè)到分析物的最低含量水平[27]?；跈z出限的篩查方法驗(yàn)證應(yīng)分析至少20個(gè)檢出限加標(biāo)量的樣品。經(jīng)實(shí)驗(yàn)考察，在10 ng/mL加標(biāo)量下，20個(gè)平行樣品中74種藥物均能檢出，滿足假陰性率<5%的要求，因此確定檢出限為10 ng/mL。空白樣品在檢出限加標(biāo)量下的回收率見(jiàn)表2，74種藥物的回收率集中在55.8%～120%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.3%～21%。由于本方法僅用于定性分析，因此對(duì)分析物的回收率無(wú)要求[27]。

2.5 實(shí)際樣品的檢測(cè)

圖1 實(shí)際樣品中檢出藥物的提取離子色譜圖Fig.1 Extract ion chromatograms of the detected compounds in real samplesA:oxytetracycline,B:3-methyl-quinoxaline-2-carboxylic acid,C:olaquindox,D:chlortetracycline,E:amoxicillin,F:trimethoprim,G:albendazole sulfoxide

3 結(jié) 論

本文利用四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜可在單次分析中迅速篩選數(shù)百種不同化合物的高分辨率優(yōu)勢(shì)，建立了豬尿中10類(lèi)74種抗生素及其他化合物的UPLC-Q-Exactive Orbitrap快速篩查和確證方法。該方法快速簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高，有效提高了檢測(cè)效率，適用于豬尿中多種抗生素及其他化合物的快速定性確證，為養(yǎng)殖業(yè)藥物使用情況的監(jiān)管提供了有力的技術(shù)支持。