覃國(guó)新,勞水兵,莫仁甫,閆飛燕,王 靜,金茂俊,何 潔,周其峰,楊玉霞,王海軍,陳 偉

(1.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與檢測(cè)技術(shù)研究所,農(nóng)業(yè)部甘蔗品質(zhì)監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(南寧),廣西 南寧 530007；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所,農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100081)

黃瓜、番茄和豇豆是人們?nèi)粘Ｉ钪谐Ｒ姷氖卟?具有生長(zhǎng)期較短、市場(chǎng)流通快等特點(diǎn),但容易受霜霉病、灰霉病、根腐病、灰色疫等病蟲的危害,雖然殺蟲劑、殺菌劑等農(nóng)藥的使用在一定程度上防治了病蟲害,并提高了蔬菜產(chǎn)量,但也造成了蔬菜中的農(nóng)藥殘留。克百威、涕滅威屬于氨基甲酸酯類農(nóng)藥,常用作殺蟲劑和殺菌劑而被廣泛應(yīng)用[1-3],雖然國(guó)家已禁止使用克百威和涕滅威,但其作為高效廣譜的殺蟲劑仍廣泛用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中[4-5],克百威和涕滅威在自然界中降解比較快,在農(nóng)作物中主要以3-羥基克百威、涕滅威砜、涕滅威亞砜等代謝產(chǎn)物形式存在,對(duì)人類健康和生態(tài)環(huán)境勢(shì)必會(huì)造成嚴(yán)重的毒害[6-7]。因此,需同時(shí)監(jiān)測(cè)農(nóng)藥母體及其代謝物的殘留量,才能達(dá)到有效監(jiān)控食品安全的目的。

我國(guó)國(guó)家強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》(GB 2763-2016)[8]規(guī)定瓜類和豆類蔬菜中克百威及3-羥基克百威之和的最大殘留量為0.02 mg/kg,涕滅威及涕滅威砜、涕滅威亞砜之和的最大殘留量為0.03 mg/kg。已有檢測(cè)克百威和涕滅威的方法主要為氣相色譜法[9]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10-11]、液相色譜[12-13]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[14-15]等。但這些方法的樣品前處理需多次提取、固相萃取凈化、衍生化等操作,操作繁瑣、費(fèi)時(shí),很難滿足大批樣品的快速、高通量檢測(cè)需求。

目前,蔬菜中克百威等氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留一般采用固相萃取或QuEChERS方法進(jìn)行前處理,高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)進(jìn)行檢測(cè)[16-17]；而采用通過式固相萃取凈化進(jìn)行樣品前處理的研究?jī)H有幾篇文獻(xiàn)報(bào)道,如勵(lì)炯等采用通過式固相萃取技術(shù),提取液使用Oasis PRiME HLB固相萃取柱通過式凈化,建立了特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中13種非法添加降糖類化學(xué)成分的分析方法,方法無需復(fù)雜的樣品前處理,不僅有效降低了基質(zhì)效應(yīng),而且提高了分析的靈敏度和選擇性[18]；高潔等采用新型通過式固相萃取技術(shù)結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,建立了同時(shí)測(cè)定豬肉中52種同化激素的快速分析方法,樣品經(jīng)乙腈渦旋提取后,用Oasis PRiME HLB固相萃取柱通過式凈化,多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式檢測(cè),不僅操作簡(jiǎn)單,分析速度快；而且靈敏度高,準(zhǔn)確可靠[19]?？梢?采用通過式固相萃取凈化技術(shù),大大縮短了樣品前處理時(shí)間,從而有效提高檢測(cè)效率。但目前尚未見采用通過式固相萃取技術(shù)對(duì)黃瓜、番茄和豇豆等蔬菜中克百威和涕滅威及其代謝物殘留進(jìn)行前處理的研究報(bào)道。因此，本研究采用乙腈和QuEChERS提取鹽包提取,經(jīng)Oasis PRiME HLB柱通過式固相萃取凈化,超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法測(cè)定,建立了同時(shí)檢測(cè)黃瓜、番茄和豇豆中克百威、3-羥基克百威、涕滅威、涕滅威砜和涕滅威亞砜殘留的分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Xevo TQ-S型超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(UPLC-MS/MS)(配有電噴霧離子源,美國(guó)Waters公司)；DS-1型高速組織搗碎機(jī)(上海標(biāo)模儀器廠)；LD5-2A型低速離心機(jī)(北京京立離心機(jī)有限公司)；Oasis PRiME HLB通過式固相萃取柱(3 cc,150 mg,2 mL,部件號(hào)186008717,使用前無需活化,沃特世科技(上海)有限公司)；克百威(1 000 mg/L)和3-羥基克百威(1 000 mg/L)標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于北京振翔科技有限公司；涕滅威(100 mg/L)、涕滅威砜(100 mg/L)和涕滅威亞砜(100 mg/L)標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)于上海安普實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；QuEChERS提取鹽包(含0.5 g檸檬酸二鈉鹽水合物、1 g 無水檸檬酸鈉、1 g氯化鈉、4 g MgSO4,部件號(hào)186006813,沃特世科技(上海)有限公司)；乙腈(色譜純,賽默飛世爾(中國(guó))科技有限公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確移取2種農(nóng)藥及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)溶液,用乙腈配成質(zhì)量濃度為10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間混合溶液,使用時(shí)用溶劑或空白基質(zhì)提取液逐級(jí)稀釋至所需濃度。

1.3 樣品前處理

取新鮮黃瓜、番茄和豇豆試樣(購(gòu)于本地市場(chǎng))，用組織搗碎機(jī)粉碎并混勻,準(zhǔn)確稱取10.00 g,加入20.0 mL乙腈,渦旋提取1 min,再加入QuEChERS提取鹽包,渦旋提取1 min,以4 000 r/min離心5 min,收集上清液,供Oasis PRiME HLB固相萃取柱凈化。

將Oasis PRiME HLB固相萃取柱(無需活化)安裝到預(yù)先清潔過的錐形瓶上,取2 mL上清液通過Oasis PRiME HLB柱并收集全部濾液,過0.22 μm有機(jī)微孔濾膜,供UPLC-MS/MS測(cè)定。

1.4 超高效液相色譜-質(zhì)譜條件

1.4.1 色譜條件色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm,美國(guó)Waters公司)；流動(dòng)相：A為乙腈,B為0.1%甲酸溶液。梯度洗脫程序：0～0.8 min,10%～40% A；0.8～2.8 min,40%～60% A；2.8～3.8 min,60%～80% A；3.8～4.7 min,80%～90% A；4.7～5.7 min,90% A；5.7～6.0 min,90%～10% A；6.0～7.0 min,10% A；柱溫35 ℃,流速0.3 mL/min,進(jìn)樣體積2.0 μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件采用電噴霧ESI+離子源,多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式,脫溶劑氣溫度400 ℃,電噴霧電壓3.0 kV,離子源溫度150 ℃,脫溶劑氣流速700 L/h。在分析過程中,以離子對(duì)(母離子和兩個(gè)子離子)信息進(jìn)行定性分析；以母離子和響應(yīng)值最高的子離子進(jìn)行定量分析。克百威、3-羥基克百威、涕滅威、涕滅威砜、涕滅威亞砜在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 克百威、3-羥基克百威、涕滅威、涕滅威砜和涕滅威亞砜的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS/MS parameters for the analysis of carbofuran,carbofuran-3-hydroxy,aldicarb,aldicarb-sulfone and aldicarb-sulfoxide

*quantitative ion

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件的優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化采用0.5 mg/L待測(cè)化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別在正離子(ESI+)和負(fù)離子(ESI-)模式下進(jìn)行全掃描。結(jié)果顯示,2種殺蟲劑及其代謝物均在ESI+模式下響應(yīng)值更高,因此選擇正離子掃描方式,并確定了克百威、3-羥基克百威、涕滅威、涕滅威砜、涕滅威亞砜母離子分別為m/z222.1、238.0、213.1、223.0、207.0。其它優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.1.2 色譜條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)對(duì)比了甲醇和乙腈為有機(jī)流動(dòng)相的分析效果,發(fā)現(xiàn)采用乙腈時(shí)各待測(cè)物峰形較好且響應(yīng)值更高,因此選擇乙腈-0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相,并優(yōu)化了流動(dòng)相梯度洗脫條件,使待測(cè)農(nóng)藥的靈敏度和重現(xiàn)性均較好。另外,實(shí)驗(yàn)比較了BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)和HSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)2種色譜柱的分離效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用BEH C18色譜柱分析時(shí),待測(cè)農(nóng)藥的峰形和保留時(shí)間均較理想。在優(yōu)化色譜-質(zhì)譜條件下,2種農(nóng)藥及其代謝物在黃瓜、番茄和豇豆加標(biāo)樣品中的MRM色譜圖如圖1所示,由圖可見,樣品基質(zhì)不干擾2種農(nóng)藥及其代謝物的測(cè)定。

圖1 2種殺蟲劑及其代謝物在黃瓜、番茄和豇豆混合空白樣品基質(zhì)加標(biāo)(0.05 mg/kg)下的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of 2 kinds of insecticides and its metabolites of mixed blank samples of cucumber,tomato and cowpea spiked at 0.05 mg/kg level

2.2 凈化方式的選擇

樣品的提取和凈化作為檢測(cè)方法的關(guān)鍵技術(shù),直接影響方法的回收率、靈敏度和精密度,尤其是植物源性食品中存在的大量色素會(huì)隨著目標(biāo)化合物被提取出來,基質(zhì)干擾嚴(yán)重。本文采用乙腈渦旋提取1 min,加入QuEChERS提取鹽包,再渦旋提取1 min,離心后,上清液直接加載至Oasis PRiME HLB固相萃取柱以吸附色素等干擾物質(zhì),與傳統(tǒng)非通過式固相萃取凈化比較,本方法上樣前無需活化和平衡柱子,且不涉及洗脫和濃縮程序,顯著縮短了樣品前處理時(shí)間,操作更簡(jiǎn)單,且方法回收率和精密度均滿足檢測(cè)要求。

2.3 樣品基質(zhì)效應(yīng)的考察

取不含待測(cè)物的黃瓜、番茄和豇豆空白樣品,經(jīng)“1.3”方法處理后,到空白基質(zhì)提取凈化液,用此基質(zhì)提取凈化液逐級(jí)稀釋10 mg/L的待測(cè)物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,配成0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5 mg/L的基質(zhì)提取凈化標(biāo)準(zhǔn)工作液。在優(yōu)化的條件下進(jìn)樣測(cè)定,以待測(cè)物質(zhì)量濃度(X,mg/L)為橫坐標(biāo),對(duì)應(yīng)定量離子對(duì)峰面積(Y)為縱坐標(biāo)繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。以基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率/純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線斜率計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)(ME),斜率比越接近1,表示基質(zhì)效應(yīng)越小,結(jié)果見表2。結(jié)果顯示,克百威和涕滅威及其代謝物3-羥基克百威、涕滅威砜、涕滅威亞砜均存在較大的基質(zhì)效應(yīng)(ME<0.8),這可能與樣品基質(zhì)、化合物性質(zhì)和離子化效果等因素相關(guān)。因此,為減小樣品基質(zhì)效應(yīng),本實(shí)驗(yàn)選擇基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法定量。

表2 黃瓜、番茄和豇豆中2種殺蟲劑及其代謝物的基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Matrix effects of 2 kinds of insecticides and its metabolites residues in matrix of cucumber,tomato and cowpea

2.4 方法的線性范圍、檢出限與定量下限

在優(yōu)化條件下,黃瓜、番茄和豇豆中的克百威、3-羥基克百威、涕滅威、涕滅威砜和涕滅威亞砜在0.001～0.5 mg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系(見表2),相關(guān)系數(shù)均大于0.996 0。以3倍信噪比(S/N=3)計(jì)算得克百威、3-羥基克百威、涕滅威、涕滅威砜和涕滅威亞砜的檢出限(LOD)分別為0.07、0.3、1.0、4.0、13 μg/kg,以S/N=10計(jì)算得其定量下限(LOQ)分別為0.2、1.0、2.0、13、42 μg/kg。方法中各待測(cè)物的LOD均比國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)值低[8],完全滿足日常檢測(cè)需求。

2.5 回收率與精密度

取市售未檢出2種農(nóng)藥及其代謝物的黃瓜、番茄和豇豆樣品為空白進(jìn)行低、中、高3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)(通過式凈化方式和非通過式凈化方式比較),10 g勻漿樣品中克百威、3-羥基克百威、涕滅威和涕滅威砜加標(biāo)濃度為0.02、0.05、0.2 mg/kg,涕滅威亞砜為0.05、0.1、0.2 mg/kg,在優(yōu)化條件下測(cè)定,結(jié)果見表3。結(jié)果顯示,克百威和涕滅威及其代謝物3-羥基克百威、涕滅威砜、涕滅威亞砜在黃瓜、番茄和豇豆中通過式和非通過式2種凈化方式的平均回收率分別為80.4%～110%和74.5%～99.6%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.1%～4.8%和1.4%～5.9%。由此可見,2種方法的回收率和精密度均滿足檢測(cè)要求,但本方法操作更簡(jiǎn)單,樣品前處理時(shí)間更短,且回收率整體較高。

表3 實(shí)際樣品中2種殺蟲劑及其代謝物殘留量回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Recoveries and RSD(n=6) of 2 kinds of insecticides and its metabolites resideces in real samples

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

從本地農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)分別隨機(jī)抽取10份黃瓜、番茄和豇豆對(duì)其中的克百威、3-羥基克百威、涕滅威、涕滅威砜和涕滅威亞砜進(jìn)行檢測(cè),均未檢出上述農(nóng)藥殘留。

3 結(jié) 論

本研究采用新型通過式固相萃取技術(shù),建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定黃瓜、番茄和豇豆中克百威和涕滅威及其代謝物(3-羥基克百威、涕滅威砜、涕滅威亞砜)殘留的分析方法。采用通過式固相萃取技術(shù),上樣前無需活化和平衡,以O(shè)asis PRiME HLB替代常規(guī)填料GCB對(duì)樣品進(jìn)行凈化,不但能去除色素、磷脂等干擾雜質(zhì)且能保持待測(cè)物較高的回收率,同時(shí)有效的縮短了樣品前處理時(shí)間,方法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、定量下限低、穩(wěn)定可靠,滿足蔬菜中克百威和涕滅威及其代謝物殘留檢測(cè)與確證的需要。將其用于黃瓜、番茄和豇豆中克百威和涕滅威及其代謝物殘留的檢測(cè)分析,結(jié)果令人滿意。