張翠真, 袁小龍, 陳志和, 毛振方, 簡(jiǎn)少卿,2, 趙大顯,2
(1. 南昌大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 南昌 330031; 2. 江西省水產(chǎn)動(dòng)物資源與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 南昌 330031)
核酸的分子生物學(xué)技術(shù)是進(jìn)行病原微生物檢測(cè)、物種鑒定、物種起源、多樣性評(píng)估及其親緣關(guān)系、系統(tǒng)進(jìn)化等常用研究手段之一。能否提取出高質(zhì)量的核酸則是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的關(guān)鍵,提取方法的靈敏度、特異性也將直接關(guān)系到后續(xù)試驗(yàn)的成敗。因此,核酸提取是分子生物學(xué)最關(guān)鍵的方法之一[1]。
隨著分子生物學(xué)的廣泛應(yīng)用,對(duì)核酸提取技術(shù)也提出了新的要求,高效、便捷、環(huán)保、大通量、自動(dòng)化成為核酸提取技術(shù)發(fā)展的主流方向。從第1代化學(xué)法[2-6],如酚-氯仿法、Trizol法,到第2代吸附柱法[2],以及近年發(fā)展起來的第3代磁珠法[7-11],其提取技術(shù)和效率不斷地改進(jìn)優(yōu)化。
本研究通過納米磁珠法提取純化細(xì)菌基因組DNA、總RNA和質(zhì)粒DNA,并與試劑盒法和Trizol法提取效果進(jìn)行比對(duì)分析,以期獲得最佳的提取方法,為核酸提取技術(shù)提供理論數(shù)據(jù)。
SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)自上海生工,Universal Genomic DNA Extraction Kit購(gòu)自Takara,Trizol試劑購(gòu)自ABI。細(xì)菌 RNAOμT購(gòu)自北京天恩澤基因科技有限公司。
PCR所需引物序列上游(5′-CAATATCAGCGATGCCGAACGTAT-3′)和下游引物(5′-TACCATCACCTACCACCGAGATAA-3′)均由上海生工合成。
1.2.1 細(xì)菌基因組DNA提取
試劑盒法按照Universal Genomic DNA Extraction Kit說明書要求操作。
納米磁珠法提取大腸桿菌基因組DNA:取2 mL大腸桿菌DH10B(E.coliDH10B)培養(yǎng)液,9000 r/min離心,加入500 μL Lysis buffer II,混勻,室溫裂解5 min,加入200 μL氯仿/異戊醇(24∶ 1),振蕩30 s,13 000 r/min離心5 min;取200 μL上清液加入200 μL磁珠懸液,振蕩混勻,室溫吸附5 min,靜置 20 s,吸出上清液;加入 500 μL 75%乙醇,混勻,靜置 20 s,吸出上清液;加入70 μL TE buffer,混勻,室溫放置10 min,靜置20 s,保存?zhèn)溆茫粶y(cè)定核酸樣品的A260,A260/A280,計(jì)算回收率,1%的瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定基因組DNA質(zhì)量。
1.2.2 PCR 檢測(cè)
將兩種方法提取的基因組DNA稀釋至30 ng/μL進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
25 μL PCR反應(yīng)體系:5 μL 5×PCR buffer,0.5 μL上游引物(10 μmol/L),0.5 μL下游引物(10 μmol/L),0.5 μL dNTP mix(各2.5 mmol/L),1 μL基因組DNA(30 ng/μL),15.5 μL去離子水,0.5 μLTaqDNA polymerase(5 U/μL),混勻。
PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性4 min;95 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,30個(gè)循環(huán);72 ℃再延伸5 min,PCR反應(yīng)完成后,將產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳觀察。
1.2.3 PCR 產(chǎn)物純化
試劑盒法按照SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒說明書操作。
納米磁珠法純化PCR產(chǎn)物:100 μL PCR反應(yīng)液中加入500 μL buffer PB、100 μL磁珠懸浮液和500 μL無水乙醇,混勻,室溫吸附5 min,靜置 20 s,吸出上清液;加入 500 μL 75%乙醇,混勻,靜置 20 s,吸出上清液后室溫晾干15 min;加入 100 μL TE buffer,混勻,室溫吸附10 min,靜置 20 s,保存?zhèn)溆谩?%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),測(cè)定純化后DNA樣品濃度,計(jì)算回收率。
1.2.4 DNA膠回收
試劑盒法按照SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒說明書操作。
納米磁珠法膠回收DNA:從瓊脂糖凝膠中切下含目標(biāo)片段的膠塊、稱重。加4倍膠重的buffer PG,50℃水浴溶解;加入100 μL 磁珠懸浮液和buffer PG等體積的無水乙醇,混勻,室溫吸附5 min,靜置 20 s,吸出上清液;加入 500 μL 75%乙醇,混勻,靜置 20 s,吸出上清液,晾干 10~15 min。加入 100 μL TE bμffer,混勻,室溫吸附10 min,靜置 20 s,將 DNA 溶液轉(zhuǎn)移至新的EP管中保存。測(cè)定膠回收后DNA樣品的濃度,計(jì)算回收率,1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
1.2.5 質(zhì)粒DNA提取
試劑盒提取法按照SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒說明書操作。
納米磁珠法提取質(zhì)粒DNA:將攜帶有PBV220質(zhì)粒的E.coliDH10B接種于5 mL Amp抗性的LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃,200 r/min 振蕩培養(yǎng)過夜;取4 mL菌液到EP管中,9000 r/min離心,加入250 μL Buffer P1,吹打懸浮,加入250 μL Buffer P2,混勻,室溫裂解3 min;加入350 μL Buffer P3,混勻,室溫靜置1 min,13 000 r/min離心5 min,取上清液,加入400 μL 無水乙醇和200 μL MNPS懸液,振蕩混勻,室溫吸附5 min,靜置 20 s,去除上清液,加入 500 μL 75%乙醇,混勻,靜置 20 s,去除上清液,室溫晾干15 min,加入 70 μL TE buffer,混勻,室溫放置10 min,靜置 20 s,將 DNA 溶液轉(zhuǎn)移至新的EP管中保存。測(cè)定核酸樣品的濃度、A260/A280,1%的瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定質(zhì)粒DNA樣品的完整性。
1.2.6 質(zhì)粒酶切檢測(cè)
用去離子水將1.2.5中兩種方法提取的質(zhì)粒DNA稀釋至50 ng/μL。
50 μL酶切反應(yīng)體系:5 μL 10×QuickCut Buffer,10 μL質(zhì)粒DNA(50 ng/μL),1 μL QuickCutHind III,ddH2O補(bǔ)足50 μL。37 ℃孵育3 h后,將酶切產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳,觀察。
1.2.7 細(xì)菌總RNA提取
試劑盒和Trizol法按說明書操作。
納米磁珠法提取E.coliDH10B總RNA:離心收集2 mL 新鮮培養(yǎng)的細(xì)菌,加入500 μL Lysis buffer I,混勻,室溫裂解5 min;加入200 μL氯仿/異戊醇(24∶ 1),振蕩30 s,13 000 r/min離心5 min;取200 μL上清到一新的EP管中,加入200 μL MNPS懸液,振蕩混勻,室溫吸附5 min,靜置 20 s,去除上清液;加入 500 μL 75%乙醇,混勻,靜置 20 s,去除上清液,室溫晾干15 min;加入 70 μL TE buffer,混勻,室溫洗脫10 min,靜置 20 s,將RNA溶液轉(zhuǎn)移至新的EP管中,-80℃保存。測(cè)定RNA樣品的濃度、A260/A280,1%的瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定總RNA樣品的完整性。
本研究用磁珠法和試劑盒法分別從2 mL菌液中提取到83.2 μg和35.8 μg基因組DNA,A260/A280分別為1.83和1.84,兩種方法提取的基因組DNA都比較完整,未發(fā)生降解,沒有蛋白污染,用磁珠法提取的基因組DNA條帶(Lane 2)比試劑盒法提取的(Lane 1)更亮(圖1)。
M:DL2000 Marker; 1:試劑盒提取的DNA; 2:磁珠法提取的DNA
圖1E.coliDH10B基因組DNA電泳圖
Figure 1 Genomic DNA electrophoresis ofE.coliDH10B
用兩種方法提取的基因組DNA分別作為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果均能擴(kuò)增出大小1 kb左右的目的條帶(圖2)。但磁珠法提取的DNA擴(kuò)增后顯示出唯一一條清晰可見的條帶(Lane 1),而以試劑盒提取的DNA作為模板時(shí),PCR產(chǎn)物中有少量微弱的非特異性條帶(Lane 2)。
M:DL2000 Marker; 1:磁珠法提取的基因組DNA作為PCR模板; 2:試劑盒提取的基因組DNA作為PCR模板
圖2E.coliDH10B蘇氨酸操縱子基因片段PCR產(chǎn)物電泳圖
Figure 2 Electrophoretsis of PCR product of suanine manipulation subgene fragment ofE.coliDH10B
M:DL2000 marker; 1:磁珠法直接純化的PCR產(chǎn)物; 2:試劑盒直接純化的PCR產(chǎn)物; 3:未純化的PCR產(chǎn)物
圖3純化后的PCR產(chǎn)物電泳圖
Figure 3 Electrophoresis of PCR products after purification
用磁珠法和試劑盒分別對(duì)5.2 μg的PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接純化,純化后A260/A280分別為1.91和1.86,純化后的產(chǎn)物質(zhì)量分別為4.6 μg和4.4 μg,經(jīng)計(jì)算,回收效率分別達(dá)到88.5%和84.6%,且磁珠法直接純化的PCR產(chǎn)物(Lane 1)比試劑盒直接純化的PCR產(chǎn)物(Lane 2)亮(圖3)。
實(shí)驗(yàn)使用磁珠法和試劑盒法分別對(duì)3.0 μg的PCR產(chǎn)物DNA進(jìn)行電泳并膠回收,回收后的DNAA260/A280分別為1.87和1.88,回收后的DNA質(zhì)量分別為2.3 μg和2.4 μg,經(jīng)計(jì)算,回收效率分別達(dá)到76.7%和80.0%,回收后電泳結(jié)果如圖4所示。
M:DL2000 marker; 1:磁珠法膠回收的DNA; 2:試劑盒膠回收的DNA; 3:未進(jìn)行膠回收的DNA
圖4膠回收后的DNA電泳圖
Figure 4 The DNA electrophoresis of the recovered glue
實(shí)驗(yàn)通過磁珠法和試劑盒法分別從2 mL菌液中提取到9.5 μg和10.8 μg質(zhì)粒DNA,A260/A280分別為1.84和1.82。實(shí)驗(yàn)使用的PBV220質(zhì)粒大小為3666 bp,其中有3個(gè)Hind III酶切位點(diǎn),經(jīng)Hind III酶切后,理論上會(huì)產(chǎn)生大小依次為2727 bp、815 bp、125 bp的DNA條帶,但是實(shí)際操作過程中,125 bp的DNA片段由于質(zhì)量小,很難在電泳圖譜上被觀測(cè)到。電泳圖譜顯示(圖5),兩種方法提取的質(zhì)粒電泳條帶指示的大小小于其真實(shí)大小,試劑盒法提取的質(zhì)粒(Lane 4)比磁珠法提取的質(zhì)粒(Lane 3)條帶更亮,磁珠法提取的質(zhì)粒(Lane 3)約80%為超螺旋結(jié)構(gòu),另一部分為線性或開環(huán)質(zhì)粒。試劑盒法提取的質(zhì)粒(Lane 4)約90%為超螺旋結(jié)構(gòu),另外一部分為開環(huán)質(zhì)粒。
M:1 kb DNA ladder; 1:磁珠法提取的質(zhì)粒Hind III酶切產(chǎn)物; 2:試劑盒提取的質(zhì)粒Hind III酶切產(chǎn)物; 3:磁珠法提取的質(zhì)粒; 4:試劑盒提取的質(zhì)粒
圖5PBV220質(zhì)粒DNA及其酶切電泳圖
Figure 5 PBV220 plasmid DNA and its enzymatic electrophoresis
磁珠法、試劑盒與Trizol法提取的細(xì)菌總RNA濃度分別為138、94和105 ng/μL,A260/A280分別為1.89、1.88和1.74。由圖6可知,3種方法提取的總RNA有3條帶,從上到下依次為23S rRNA,16S rRNA 和5S rRNA。其中23S rRNA 的亮度約是16S rRNA 的2倍,且條帶清晰透亮,無明顯的拖尾現(xiàn)象,說明RNA 的完整性很好。
M:DL2000 marker; 1:磁珠法提??; 2:試劑盒提??; 3:Trizol提取
圖6E.coliDH10B總RNA電泳圖
Figure 6 Total RNA electrophoresis ofE.coliDH10B
表面修飾的磁性納米粒子作為新型的功能材料, 具有磁響應(yīng)性和生物安全性[12]。在生物醫(yī)藥方面已得到廣泛應(yīng)用。磁珠法提取核酸是利用磁性納米粒子與核酸結(jié)合, 在外磁場(chǎng)的作用下達(dá)到分離純化核酸的目的[13]。Qie等[14]應(yīng)用聚酰胺-胺型樹枝狀高分子PAMAM對(duì)DNA的結(jié)合效應(yīng)將其修飾在鐵磁性納米粒子表面, 應(yīng)用修飾后的粒子提取DNA, 此方法較為新穎。對(duì)比各種傳統(tǒng)方法證明磁珠修飾法的提取效率高及過程較為便捷[15]。
由磁珠法和試劑盒法提取基因組DNA的A260/A280值在1.8~2之間可知,兩種方法提取的基因組DNA均沒有蛋白質(zhì)污染,且磁珠法從2 mL菌液中提取的基因組DNA量多于試劑盒法,從而得出磁珠法提取效率高于試劑盒法。從圖1中兩種提取方法的亮度也可知,磁珠法提取效率高于試劑盒法,同時(shí)兩種方法提取的基因組DNA都比較完整,未發(fā)生降解。但磁珠法提取的DNA中混有少量的RNA,可能是由于細(xì)胞裂解液中沒有添加RNase A所致。實(shí)驗(yàn)所建立的方法可以簡(jiǎn)便而高產(chǎn)地提取到基因組DNA,說明本研究的方法具有良好的應(yīng)用前景。
實(shí)驗(yàn)采用PCR技術(shù)檢驗(yàn)核酸的純度。圖2中試劑盒法提取的基因組DNA擴(kuò)增后的條帶2出現(xiàn)雜帶,表明模板DNA不純,其中的雜質(zhì)對(duì)TaqDNA polymerase或者引物產(chǎn)生了干擾作用,從而降低了PCR反應(yīng)的特異性。因此相比試劑盒法,磁珠提取法得到的基因組DNA純度更高。
PCR產(chǎn)物一般都含有過量的引物、dNTP、DNA聚合酶和一些離子,這些成分的存在,直接影響后續(xù)的酶切、測(cè)序、雜交、克隆等反應(yīng),因此有必要將其除去。而這兩種方法提取的產(chǎn)物與不提純之前條帶相比相差不大,說明這兩種方法都能較好地純化PCR產(chǎn)物。
在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中,很多情況需要利用瓊脂糖凝膠電泳觀察、純化和回收DNA片段,特別是在進(jìn)行基因的預(yù)測(cè)、篩選、克隆和轉(zhuǎn)化及不同類型DNA片段進(jìn)行純化和回收,然后克隆和測(cè)序,需要準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)的瓊脂糖凝膠DNA回收方法[16]。
質(zhì)粒DNA提取效率及質(zhì)量關(guān)系到分子克隆的全過程,建立高效而快速的質(zhì)粒DNA提取方法對(duì)提高分子生物學(xué)研究具有重要意義[17]。傳統(tǒng)的質(zhì)粒DNA提取方法大多基于離心、沉淀或色譜分離,普遍存在操作時(shí)間長(zhǎng)、離心次數(shù)多、接觸有毒試劑及成本偏高等特點(diǎn)[18]。
兩種方法提取的質(zhì)粒都能被限制性內(nèi)切酶Hind III完全切開,酶切后的電泳條帶與理論相符,進(jìn)一步說明提取到的質(zhì)粒DNA純度較高,沒有抑制內(nèi)切酶活性的雜質(zhì)存在。
RNA是生物體內(nèi)的遺傳物質(zhì),不僅可以是信息的攜帶者,還可以是功能的執(zhí)行者,在生物體內(nèi),RNA執(zhí)行著多種代謝功能。獲取高質(zhì)量的RNA與分子生物學(xué)研究密切相關(guān)[19-20],因此,如何使提取的RNA純度變得越好,濃度越高,成為深入研究的關(guān)鍵。由提取的RNA濃度可知磁珠法提取的RNA濃度最高,由Trizol法提取RNA的A260/A280值小于1.8可知,其提取的RNA純度較低。但磁珠法和試劑盒提取到的總RNA中有基因組DNA的污染,不過這些DNA能通過加入DNaseI的方法除去,而Trizol法不存在基因組DNA污染的情況,但Trizol試劑中加入了苯酚,對(duì)人體有毒性,并且苯酚的殘留將影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。相比之下,磁珠法和試劑盒法更加環(huán)保安全。
采用磁珠法和試劑盒法與Trizol法對(duì)核酸進(jìn)行提取與純化。與試劑盒法和Trizol法相比,磁珠法在細(xì)菌基因組DNA和RNA提取、PCR產(chǎn)物檢測(cè)及純化中效率更高;而在PCR產(chǎn)物回收和質(zhì)粒DNA的提取中,效率低于試劑盒法,質(zhì)粒酶切效果與試劑盒法無差異。結(jié)果表明,納米磁珠法相比試劑盒法和Trizol法在核酸提取純化效果上更佳。