楊淑鳳 , 鄧國(guó)英, 孫文長(zhǎng)

(大連醫(yī)科大學(xué) 微生物學(xué)教研室, 大連 116044)

結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,M.tb)所引起的人類結(jié)核病是全球性危害嚴(yán)重的傳染病之一。WHO結(jié)核病報(bào)告顯示， 2016年全球結(jié)核病患者約1040萬(wàn)例， 2016年因結(jié)核病死亡人數(shù)為167萬(wàn)，列傳染病死亡人數(shù)首位[1]。在中國(guó)共有結(jié)核病例89.5萬(wàn)，同年死亡5萬(wàn)[1]，因此結(jié)核病的防控尤為重要?？ń槊?Bacillus Calmette-Guérin，BCG)作為唯一許可應(yīng)用的預(yù)防結(jié)核病的疫苗，在一定程度上能降低兒童播散性結(jié)核，如結(jié)核性腦炎和粟粒樣結(jié)核的發(fā)病，但不能提供長(zhǎng)期免疫，也無(wú)法預(yù)防成人肺結(jié)核的發(fā)病[2]。而候選疫苗的保護(hù)力與傳統(tǒng)卡介苗相比并無(wú)差異，因此全面認(rèn)識(shí)卡介苗的抗原性物質(zhì)和免疫機(jī)制非常關(guān)鍵[2]。甘露糖復(fù)合物抗原是分枝桿菌細(xì)胞壁上一類重要的抗原，包括脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan，LAM)、莢膜阿拉伯甘露聚糖和甘露糖基化蛋白[3]。其中甘露糖基化蛋白在結(jié)核分枝桿菌和恥垢分枝桿菌中均有報(bào)道，例如最早確定的結(jié)核分枝桿菌甘露糖蛋白為富含丙氨酸脯氨酸的分泌蛋白(alanine/proline-rich secreted protein)，即Apa和PstS1[4]。而且各甘露糖蛋白的甘露糖殘基連接方式也不盡相同，例如Apa的4個(gè)糖基化位點(diǎn)Thr上甘露糖殘基連接方式均為ɑ-1，2連接，而同樣也是具有4個(gè)Thr糖基化位點(diǎn)的Mpb83，則有2個(gè)位點(diǎn)上甘露糖殘基以ɑ-1，3連接[5]。不同的糖鏈連接方式也影響與宿主細(xì)胞特異受體的識(shí)別，Apa能被宿主細(xì)胞甘露糖受體(mannose receptors, MR)識(shí)別，并參與結(jié)核菌的免疫逃逸。而Mpb83不能被MR識(shí)別[5]。此外，催化結(jié)核分枝桿菌O-甘露糖基化蛋白合成路徑中關(guān)鍵酶：蛋白甘露糖基轉(zhuǎn)移酶(protein mannosyl transferase，PMT)Rv1002c本身就是個(gè)毒力因子[6]。因此，甘露糖基化蛋白在細(xì)菌致病性和宿主細(xì)胞相互作用過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。而卡介苗中甘露糖基化蛋白的研究不多，因此本文基于刀豆素凝集素(Concanavalin A，ConA)親和層析技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)開展了O-甘露糖基化蛋白的研究。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌和培養(yǎng)條件

使用的BCG為中國(guó)普遍使用的疫苗(成都生物制品研究所有限責(zé)任公司,國(guó)藥準(zhǔn)字S20013057 )，在7H10固體培養(yǎng)基(含有10%ADC)復(fù)蘇，挑取單個(gè)菌落至5 mL蘇通培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)10 d后，轉(zhuǎn)至200 mL蘇通培養(yǎng)基，37 ℃靜止培養(yǎng)10 d后收獲培養(yǎng)濾出液。

1.2 培養(yǎng)濾出液(Culture filter，CF)中蛋白的提取

將細(xì)菌培養(yǎng)液通過(guò)0.22 μm的濾膜，收獲CF。與0.5 g/mL的(NH4)2SO4等體積比混合，4 ℃過(guò)夜，10 300 r/min離心0.5 h，收獲沉淀，ddH2O重懸。采用10 ku的透析膜放置于PBS中，4 ℃透析3 d除鹽。冷凍真空干燥并稱重。

1.3 ConA瓊脂糖親和層析獲得O-甘露糖基化蛋白

先用預(yù)洗緩沖液(1 mol/L NaCl, 5 mmol/L MgCl2,5 mmol/L MnCl2和 5 mmol/L CaCl2)沖洗ConA瓊脂糖層析柱(Concanavalin A-SepharoseR4B， Sigma)，然后應(yīng)用平衡緩沖液(20 mmol/L Tris，0.5 mol/L NaCl，pH 7.4)平衡層析柱。CF中的蛋白用ddH2O配成濃度為1 mg/mL，流經(jīng)層析柱。應(yīng)用平衡緩沖液沖洗直至洗出液中無(wú)蛋白檢出。最后應(yīng)用200 mmol/L甘露糖苷洗脫目的蛋白，收獲洗脫液并濃縮。

1.4 O-甘露糖蛋白的確證和解析

利用15%的SDS-PAGE分離收獲的目的蛋白，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，封閉液為1.5%的BSA，封閉時(shí)間30 min。然后使用1∶ 10 000的生物素標(biāo)記的ConA(Sigma)室溫孵育30 min后，洗膜，再使用1∶ 5000的HRP標(biāo)記鏈霉親和素(Sigma)室溫孵育30 min后，洗膜，化學(xué)發(fā)光顯色。同時(shí)電泳后的條帶銀染(ProteoSilverTMPlus，Sigma)，顯色后將各蛋白條帶切下質(zhì)譜分析。使用的質(zhì)譜儀器為基質(zhì)輔助激光飛行時(shí)間質(zhì)譜儀5800 MALDI-TOF/TOF(AB SCIEX)。

1.5 O-甘露糖蛋白的解析

將各蛋白的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行解析，并使用在線甘露糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)NetOGlyc 4.0 Server進(jìn)行各蛋白的糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)解析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ConA瓊脂糖親和層析洗脫液SDS-PAGE的銀染結(jié)果

SDS-PAGE分離CF中收獲的目的蛋白，并進(jìn)行銀染。結(jié)果如圖 1箭頭所示，共檢測(cè)到約7個(gè)蛋白條帶。依據(jù)分子量大小標(biāo)注為條帶1～7。

箭頭所示為銀染顯色條帶，共檢測(cè)到約7個(gè)條帶。染色方法為銀染色。1:洗脫液；M:蛋白Marker(Fermentas)

圖1ConA瓊脂糖親和層析洗脫液SDS-PAGE結(jié)果

Figure 1 SDS-PAGE of CF with Con-A sepharose affinity

2.2 ConA瓊脂糖親和層析洗脫液印記確證結(jié)果

洗脫液利用生物素標(biāo)記的ConA檢測(cè)。結(jié)果如圖 2所示，與SDS-PAGE銀染一致，糖蛋白條帶用箭頭顯示，條帶位置與圖 1銀染條帶的偏差可能是糖型所致。

2.3 O-甘露糖基化蛋白質(zhì)譜解析和糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果

將圖 1中的1～7條帶切下，進(jìn)行各條帶的質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析，并進(jìn)行糖基化位點(diǎn)和蛋白功能預(yù)測(cè)。結(jié)果(表1)顯示，這7個(gè)蛋白均為甘露糖蛋白，具有不同的蛋白功能，糖基化位點(diǎn)多位于Ser和Thr上，位點(diǎn)總數(shù)從1個(gè)到16個(gè)不等。

箭頭所示為檢測(cè)到的糖蛋白條帶

圖2ConA瓊脂糖親和層析洗脫液Western-blot

Figure 2 Western-blot of CF with Con-A sepharose affinity

表 1 CF中甘露糖化蛋白質(zhì)譜結(jié)果和糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

3 討論

ConA能特異識(shí)別甘露糖，因此廣泛用于甘露糖基化蛋白的富集和確證[7]。本研究利用ConA親和技術(shù)富集了卡介苗培養(yǎng)濾出液中的甘露糖蛋白，并用ConA印記實(shí)驗(yàn)確證了這些糖蛋白均為甘露糖蛋白(圖 1和圖 2)。使用SDS-PAGE分離各蛋白，并經(jīng)過(guò)質(zhì)譜解析了這些糖蛋白。最終確定了BCG培養(yǎng)濾出液中的7種甘露糖蛋白，如表1所示。蛋白條帶2就是與Apa同源的BCG中富含丙氨酸/脯氨酸的分泌蛋白。

BCG培養(yǎng)濾出液存在的蛋白多為分泌蛋白，本研究所確定出的7種甘露糖基化蛋白，經(jīng)預(yù)測(cè)大多具有酶活性(表1)，可能在細(xì)菌修復(fù)、糖鏈代謝、呼吸代謝等過(guò)程中發(fā)揮作用。以Apa為例，結(jié)核分枝桿菌Apa可增強(qiáng)T細(xì)胞抗原性和誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平IFN-γ[8]，并且其O甘露糖基化修飾是刺激T淋巴細(xì)胞所必需的[9]。BCG中的Apa是否具有相同的功能未知。本次所確定出的這些甘露糖蛋白確切功能還需要具體實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BCG中甘露糖基化蛋白無(wú)論在糖基化位點(diǎn)還是發(fā)生糖基化的氨基酸與結(jié)核分枝桿菌中的同源的甘露糖基化蛋白并不完全相同。還是以Apa為例，BCG中Apa的甘露糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)為8個(gè)，也多于結(jié)核菌分枝桿菌Apa的4個(gè)位點(diǎn)[4]。此外，結(jié)核分枝桿菌Apa發(fā)生甘露糖基化的氨基酸均為Thr[4]，而BCG的Apa發(fā)生甘露糖基化的預(yù)測(cè)氨基酸除了7個(gè)Thr外，還有1個(gè)為Ser。當(dāng)然產(chǎn)生如此差異也可能是由于BCG只是軟件預(yù)測(cè)，最終還需具體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

Geoffrey等借助質(zhì)譜技術(shù)共確證了13種結(jié)核分枝桿菌O-甘露糖蛋白[10]。我們從BCG培養(yǎng)濾出液中分離出7種O-甘露糖蛋白，數(shù)量少于結(jié)核分枝桿菌。一方面與菌種不同有關(guān)，另一方面和本研究使用的單向電泳有關(guān)。使用雙向電泳分離更多的BCG甘露糖基化蛋白，是將來(lái)需要開展的工作。

BCG中O-甘露糖基化蛋白的確證有利于BCG免疫機(jī)制的認(rèn)識(shí)，從中篩選出重要的糖基化蛋白進(jìn)行基因水平上的調(diào)控，構(gòu)建甘露糖蛋白表達(dá)水平上調(diào)的重組BCG，也是改造優(yōu)化BCG的途徑之一。