侯愛香，顏道民，孫靜文，鄭旭，李賽丹*，肖潤花，貝爽

綠茶、紅茶和茯磚茶水提物對腸道微生物體外發(fā)酵特性的影響

侯愛香1,3，顏道民2，孫靜文4，鄭旭1，李賽丹4*，肖潤花4，貝爽4

1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)國際學(xué)院，湖南 長沙 410128；3. 國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410128；4. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方科技學(xué)院，湖南 長沙 410128

為探究不同茶樣的水提物與腸道微生物的互作效應(yīng)，以健康大學(xué)生糞便為菌源，采用體外厭氧發(fā)酵模式，結(jié)合傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)和氣相色譜法，研究綠茶、紅茶和茯磚茶的水提物24?h體外發(fā)酵過程中pH值、短鏈脂肪酸、腸道微生物的變化，并計(jì)算益生元指數(shù)PI（Prebiotic Index）和B/E值（）。結(jié)果表明綠茶、紅茶和茯磚茶水提物均會(huì)引起發(fā)酵液的pH大幅下降，其中茯磚茶組的pH下降幅度最大。同時(shí)，3種茶葉水提物都能顯著增加短鏈脂肪酸的產(chǎn)量，其中綠茶對乙酸、丙酸、異丁酸、異戊酸、戊酸和總短鏈脂肪酸的提高效果最佳，而茯磚茶對丁酸的提高幅度最大。3種茶葉水提物都能調(diào)節(jié)腸道微生物的結(jié)構(gòu)組成，促進(jìn)雙歧桿菌的增長，抑制擬桿菌、腸桿菌和梭狀芽孢桿菌的生長；其中茯磚茶組對雙歧桿菌的促進(jìn)作用最大，對腸桿菌和梭狀芽孢桿菌的抑制效果最明顯，綠茶組對擬桿菌的抑制效果最大；但綠茶組和紅茶組都能促進(jìn)乳桿菌的增殖，茯磚茶組卻表現(xiàn)出抑制作用。另外通過分析PI值和B/E值，發(fā)現(xiàn)綠茶、紅茶和茯磚茶組都具有良好的益生作用，4?h階段茯磚茶組的益生元指數(shù)PI值最大，發(fā)酵8、12、24?h階段綠茶組益生元指數(shù)PI值最大；而整個(gè)發(fā)酵過程茯磚茶組的B/E均保持最大。本研究為不同茶葉在青年消費(fèi)市場中的進(jìn)一步擴(kuò)大推廣提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和科學(xué)依據(jù)。

綠茶；紅茶；茯磚茶；體外發(fā)酵；短鏈脂肪酸；腸道微生物

人體腸道棲居著大量微生物，它們在腸道中形成了一個(gè)極其復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，越來越多的研究[1-2]表明腸道微生物與人體健康密切相關(guān)。人體腸道菌群失調(diào)或紊亂會(huì)導(dǎo)致各種疾病如糖尿病、高血壓、心腦血管疾病、代謝綜合征、腸胃炎癥、抑郁癥甚至自身免疫性疾病等的發(fā)生[3-5]。膳食是影響人體腸道健康最重要的因素之一，而腸道菌群參與膳食營養(yǎng)素的消化吸收、能量的供給、酶的形成和代謝產(chǎn)物的合成等多個(gè)過程，一方面它能提高膳食因子的生物活性和生物利用率，另一方面腸道菌群又反過來直接影響宿主免疫系統(tǒng)發(fā)育，調(diào)節(jié)新陳代謝、影響健康[6-7]。隨著人類微生物組（Human Microbiome Project，HMP）和人體腸道元基因組研究計(jì)劃（Metagenomics of the Human Intestinal Tract，MetaHIT）等項(xiàng)目研究的持續(xù)推進(jìn)，人們對腸道微生物的關(guān)注越來越多。大量研究從腸道微生物的角度關(guān)注食品甜味劑、食品乳化劑、益生元、微量元素、功能性成分、多酚類化合物等膳食因子對機(jī)體的影響，腸道微生物與膳食因子互作已成為人類闡釋膳食因子調(diào)控健康研究的熱點(diǎn)和著眼點(diǎn)[8-9]。

茶葉中含有茶蛋白、茶多酚、茶多糖和咖啡堿等多種功效成分，具有降血糖、降血脂、降血壓、抗血栓，增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗氧化、抗菌和抗輻射等多種生理功能，作為保健食品和藥品具有廣闊的開發(fā)前景[10]。青年人作為飲料消費(fèi)的主體人群，與40歲以上人群比較，其飲用茶的頻次相對較低[11]。而大量調(diào)查顯示，年輕群體未來總體飲茶意愿較高，對飲品的健康要求較高，茶葉青年人的消費(fèi)市場開發(fā)潛力較大[12-14]。如何引導(dǎo)青年群體茶葉消費(fèi)意愿，催發(fā)茶葉在大健康產(chǎn)業(yè)中蓬勃發(fā)展意義深遠(yuǎn)。為此，借鑒文獻(xiàn)[15]食品與腸道微生物互作研究的新模式，旨在通過人體腸道微生物體外發(fā)酵模型，分析發(fā)酵過程中不同茶葉水提物引起腸道微生物體外發(fā)酵體系中pH值、主要腸道菌群和SCFAs的變化情況，并結(jié)合益生元指數(shù)PI值和腸道定殖能力指標(biāo)B/E值的改變，從而探究青年人腸道菌群與綠茶、紅茶和茯磚茶水提物的體外互作效應(yīng)，借此為以后學(xué)者們進(jìn)一步研究不同茶營養(yǎng)與保健作用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為茶葉在青年消費(fèi)市場中的進(jìn)一步擴(kuò)大推廣提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅茶、綠茶和茯磚茶由湖南省白沙溪茶廠股份有限公司提供；Wilkins-Chalgren瓊脂來自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；Enterococcus瓊脂購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、BBL瓊脂培養(yǎng)基和MRS瓊脂培養(yǎng)基均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸和戊酸均購自美國Sigma公司；擬桿菌礦物鹽瓊脂按照配方[16]自制：葡萄糖15.0?g·L-1，磷酸二氫鉀4.0?g·L-1，磷酸氫二鈉2.0?g·L-1，硫酸銨0.5?g·L-1，氯化鈉9.0?g·L-1，氯化鎂0.15?g·L-1，氯化鈣0.01?g·L-1，氯化錳0.05?g·L-1，氯化鈷0.05?g·L-1，半胱氨酸0.8?g·L-1，碳酸氫鈉1.5?g·L-1，氯高鐵血紅素0.01?g·L-1，VB120.005?g·L-1，七水合硫酸鐵0.001?g·L-1，萘啶酮酸0.01?g·L-1，萬古霉素0.002?5?g·L-1，瓊脂20.0?g·L-1；含氮基礎(chǔ)培養(yǎng)基[17]：1?L純凈水含有蛋白胨2?g，酵母粉2?g，NaCl 0.1?g，K2HPO40.04?g，MgSO4·7H2O 0.01?g，CaCl2·7H2O 0.01?g，NaHCO32?g，氯化血紅素0.05?g，L-半胱氨酸0.5?g，膽汁酸鹽0.5?g，吐溫-80 2?mL，VK 10?μL，0.25?mg·mL-1刃天青4?mL，pH 6.7。試驗(yàn)用水均是超純水，培養(yǎng)基均經(jīng)過高壓蒸汽滅菌。

1.2 儀器設(shè)備

JY92-ⅡB超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波科生儀器廠；TG16-WS高速臺式離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；循環(huán)水式多用真空泵SHB-Ⅲ，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52，上海亞榮生化儀器廠；YQX-Ⅱ厭氧培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；恒溫生化培養(yǎng)箱SPX-250BS-Ⅱ，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；pH計(jì)FE20PLus，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；高壓蒸氣滅菌鍋SP500，日本YAMATO；C-43圓底立式培養(yǎng)袋，日本三菱瓦斯化學(xué)株式會(huì)社；C-1厭氧產(chǎn)氣袋，日本三菱瓦斯化學(xué)株式會(huì)社；安捷倫7890A氣相色譜儀，安捷倫科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 茶水提物的制備

將綠茶、紅茶、茯磚茶粉碎，稱取茶末各10?g，按料液比1∶50加入蒸餾水，70℃保溫浸提30?min，超聲波輔助二次浸提10?min，然后以5?000?r·min-1的轉(zhuǎn)速離心10?min，取上清液并抽濾，之后將茶水置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，最后真空冷凍干燥成凍干粉。

1.3.2 不同茶水提物與腸道微生物體外厭氧發(fā)酵

采集3位健康女大學(xué)生志愿者的新鮮糞便（采樣對象3個(gè)月內(nèi)未服用抗生素，無腸胃病史，且非生理期），再將3份糞樣混合均勻，按10%的濃度在pH為7的生理鹽水中稀釋，過濾得腸道菌群懸液。將腸道菌群懸液按10%的接種量，分別加入Control組（含氮基礎(chǔ)培養(yǎng)基）、GR-T組（含氮基礎(chǔ)培養(yǎng)基加1%綠茶水提物）、BL-T組（含氮基礎(chǔ)培養(yǎng)基加1%紅茶水提物）和FD-T組（含氮基礎(chǔ)培養(yǎng)基加1%茯磚茶水提物），在37℃恒溫條件下進(jìn)行靜態(tài)厭氧發(fā)酵，所有試驗(yàn)進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。分別于0、4、8、12、24?h取樣，用于檢測pH值、短鏈脂肪酸和主要腸道微生物。

1.3.3 pH值的檢測

采用pH計(jì)直接計(jì)數(shù)法。

1.3.4 短鏈脂肪酸的檢測

樣品處理：將發(fā)酵液在轉(zhuǎn)速為10?000?r·min-1的離心機(jī)上離心20?min，取上清液，按9∶1的比例加入25%偏磷酸，靜置反應(yīng)3?h后，通過0.22?μm的纖維濾紙，除去肉眼可見雜質(zhì)，于冰箱保存。

SCFAs采用氣相色譜外標(biāo)法測定，用乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸和異戊酸作標(biāo)準(zhǔn)曲線。將6種短鏈脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)樣品分別配置成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液（10~60?mmol·L-1），上機(jī)分析得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。以3倍的信噪比（SAN）計(jì)算6種短鏈脂肪酸的檢出限。

氣相色譜測定條件：用氫火焰檢測器（FID），載氣為N2，分流比50∶1，流速為0.8?mL·min-1，用DB-FFAP色譜柱；升溫程序：初始溫度60℃，以20℃·min-1升到220℃保持1?min；燃燒爐溫度為280℃，進(jìn)樣口溫度為250℃，進(jìn)樣量為1?μL。

1.3.5 主要腸道微生物類群計(jì)數(shù)

在嚴(yán)格的厭氧環(huán)境中，采用10倍梯度稀釋法，選擇合適的稀釋度吸取100?μL稀釋液均勻涂布于不同的選擇培養(yǎng)基上，裝入?yún)捬醮?，其中乳酸桿菌、腸球菌和大腸桿菌在37℃厭氧培養(yǎng)24~48?h，總厭氧菌和雙歧桿菌在37℃厭氧培養(yǎng)48~96?h。

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 益生元指數(shù)計(jì)算

益生元指數(shù)（Prebiotic Index，PI）是通常評價(jià)人體腸道菌群是否正常與平衡的一個(gè)重要指標(biāo)，Palframan等[18]采用的PI計(jì)算方法為眾多研究者所采納。PI計(jì)算公式如下：

PI=(Bif/Total)－(Bac/Total)＋(Lac/Total)－(Clos/Total)

式中，Total是指取樣時(shí)發(fā)酵液中總腸道菌數(shù)量（以總厭氧菌數(shù)代替）/初始總腸道菌數(shù)；Bif是指取樣時(shí)發(fā)酵液中雙歧桿菌數(shù)量/初始雙歧桿菌數(shù)；Lac是指取樣時(shí)發(fā)酵液中乳酸桿菌數(shù)量/初始乳桿菌數(shù)；Bac是指取樣時(shí)發(fā)酵液中擬桿菌數(shù)量/初始擬桿菌數(shù)；Clos是指取樣時(shí)發(fā)酵液中梭狀芽孢桿菌數(shù)量/初始梭狀芽孢桿菌數(shù)。

1.4.2 B/E值的計(jì)算

B/E值為腸道內(nèi)雙歧桿菌和腸桿菌數(shù)量的比值。早在上個(gè)世紀(jì)的70年代，Van Der Waaij等[19]荷蘭學(xué)者就將其作為腸道菌群定殖能力的指標(biāo)，一定程度上反映腸道菌群結(jié)構(gòu)。

1.4.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)均設(shè)計(jì)了3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)樣品進(jìn)行3次獨(dú)立樣品的測定，結(jié)果以±s表示，并運(yùn)用SPSS 21.0軟件的單因素分析方法（ANOVA）進(jìn)行顯著性分析；數(shù)據(jù)圖通過Origin 2017軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同時(shí)間段發(fā)酵液pH值的變化

pH值是反映腸道微生物與綠茶、紅茶和茯磚茶水提物體外互作環(huán)境體系酸堿度的指標(biāo)，腸道微生物通過代謝營養(yǎng)物質(zhì)，產(chǎn)生不同的有機(jī)酸、短鏈脂肪酸等代謝產(chǎn)物，會(huì)改變腸道微生物發(fā)酵環(huán)境的酸堿度，不同發(fā)酵體系的pH值測定結(jié)果如表1所示。

由表1可以得出，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，各發(fā)酵體系的pH都呈現(xiàn)下降趨勢，且變化曲線的趨勢大致相同，各試驗(yàn)組在發(fā)酵的前8?h內(nèi)pH普遍下降較快，隨后下降速度逐漸趨于平緩。密閉發(fā)酵環(huán)境中，前期底物充足，腸道微生物生長速度快，活性高，代謝產(chǎn)生較多酸性物質(zhì)，如有機(jī)酸、短鏈脂肪酸等，pH下降快；隨著營養(yǎng)物質(zhì)慢慢被消耗，腸道微生物生長和代謝水平下降，其pH的變化幅度不大，保持在較低水平。另外通過24?h體外發(fā)酵，空白對照組的pH下降約1.0左右，添加綠茶、紅茶和茯磚茶的發(fā)酵液分別下降約2.2、2.1、2.3左右。因此說明飲用綠茶、紅茶和茯磚茶均會(huì)較大程度迅速降低腸道內(nèi)的pH，調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)環(huán)境，從而通過酸性環(huán)境調(diào)節(jié)腸道菌群的結(jié)構(gòu)組成。

表1 各發(fā)酵體系不同發(fā)酵時(shí)間的pH

注：不同小寫字母表示同行的數(shù)據(jù)差異顯著，<0.05；不同大寫字母表示同列的數(shù)據(jù)差異顯著，<0.05

Note: Mean value with different lowercase letters in the same row was significantly different (<0.05). Mean value with different uppercase letters in the same column was significantly different (<0.05)

2.2 不同時(shí)間段發(fā)酵液中短鏈脂肪酸的變化

本文采用氣相色譜法測定不同時(shí)間段各樣品中短鏈脂肪酸的含量，以外標(biāo)法定量，發(fā)現(xiàn)6種短鏈脂肪酸都可以被氣相色譜柱有效的分離，各酸的標(biāo)準(zhǔn)品氣相色譜圖如圖1所示，乙酸的保留時(shí)間分別為10.852?min，丙酸為11.437?min，異丁酸為11.618?min，丁酸為12.039?min，異戊酸為12.314?min和戊酸為12.794?min，各短鏈脂肪酸區(qū)分清楚，該方法可以用于后續(xù)發(fā)酵體系中樣品的檢測。

短鏈脂肪酸是腸道微生物菌群發(fā)酵過程中重要的代謝產(chǎn)物，本研究測定了乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸和戊酸6種主要的短鏈脂肪酸，涵蓋了腸道微生物代謝的短鏈脂肪酸的基本種類。表2為發(fā)酵過程中對照組和3個(gè)試驗(yàn)組的6種短鏈脂肪酸乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸和總短鏈脂肪酸的含量統(tǒng)計(jì)表。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)樣品GC圖譜

由表2可知，總短鏈脂肪酸在24?h體外發(fā)酵過程中隨著時(shí)間的延續(xù)含量持續(xù)增加。其中體外發(fā)酵過程的前12?h，總短鏈脂肪酸含量FD-T>BL-T>GR-T>Control，而在24?h時(shí)總短鏈脂肪酸含量則變成GR-T>BL-T>FD-T>Control。跟對照組相比，說明綠茶、紅茶和茯磚茶水提物都會(huì)在腸道內(nèi)被微生物降解利用生成大量短鏈脂肪酸，短鏈脂肪酸是影響發(fā)酵體系pH大小的主要因素之一，其含量不斷增加導(dǎo)致發(fā)酵體系pH不斷下降，進(jìn)而調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)與組成。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)前12?h發(fā)酵體系中FD-T組的短鏈脂肪酸增幅最大，增速最快，紅茶次之，綠茶最慢。分析原因可能是茯磚茶制作經(jīng)過渥堆、發(fā)花，茶葉中生長了大量微生物，特別是“金花菌”，這些微生物已經(jīng)把茶葉中部分大分子化合物分解成了小分子的中間產(chǎn)物，腸道微生物更容易利用這些小分子的中間產(chǎn)物；紅茶制作也經(jīng)過了發(fā)酵，但發(fā)酵程度不如茯磚茶完全，綠茶制作未經(jīng)過發(fā)酵；因此FD-T組的短鏈脂肪酸含量在體外發(fā)酵前期生成量大，生成速度快，紅茶稍慢，而綠茶最慢。但在后期，由于綠茶水提物中大分子營養(yǎng)物質(zhì)不斷被腸道微生物分解利用，短鏈脂肪酸持續(xù)在體外發(fā)酵系統(tǒng)中大幅增多；而紅茶和茯磚茶水提物中的大分子營養(yǎng)物質(zhì)在茶葉制作過程中就因微生物發(fā)酵被消耗了部分，隨著其中間產(chǎn)物不斷被消耗，后期可供腸道微生物利用吸收的大分子物質(zhì)明顯不如綠茶，因此在24?h時(shí)，綠茶的短鏈脂肪酸含量最大。

由表2可知，對照組和3組試驗(yàn)組主要產(chǎn)生的短鏈脂肪酸都是乙酸、丙酸和丁酸，這個(gè)結(jié)果與張鑫等[20]的研究結(jié)果相一致。其中，乙酸是各組中含量最高的短鏈脂肪酸，其變化規(guī)律與總短鏈脂肪酸的一致，發(fā)酵結(jié)束后，綠茶、紅茶和茯磚茶組的乙酸含量分別達(dá)到了：(1?060.79±1.47)?μg·mL-1，(966.25±3.07)?μg·mL-1和(791.92±1.86)?μg·mL-1，都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對照組[(505.11±0.48)?μg·mL-1]。丙酸是各組中僅次于乙酸含量的短鏈脂肪酸，其變化規(guī)律與總短鏈脂肪酸、乙酸略有不同，發(fā)酵結(jié)束后綠茶、紅茶和茯磚茶組的丙酸含量分別達(dá)到了(608.31±1.73)?μg·mL-1，(602.85±1.68)?μg·mL-1和(414.98±0.69)?μg·mL-1，都遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于對照組[(271.24±0.77)?μg·mL-1]；但茯磚茶組最高含量出現(xiàn)在發(fā)酵12?h階段[(474.04±1.39)?μg·mL-1]，說明發(fā)酵后期，茯磚茶組的部分丙酸作為碳源被腸道微生物吸收利用了。丁酸是各組中含量第三的短鏈脂肪酸，發(fā)酵結(jié)束后各組丁酸含量變化規(guī)律為FD-T>GR-T>BL-T>Control，綠茶、紅茶和茯磚茶組分別達(dá)到(116.18±0.77)?μg·mL-1、(115.07±1.57)?μg·mL-1和(133.05±0.88)?μg·mL-1，都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對照組的(73.81±0.22)?μg·mL-1，但綠茶組和紅茶組之間的差異不大。異丁酸、異戊酸和戊酸各組含量都較小，但各試驗(yàn)組異丁酸、異戊酸和戊酸含量較對照組也有較大提升，發(fā)酵結(jié)束后，其中異丁酸和戊酸含量的大小規(guī)律是GR-T>FD-T>BL-T>Control，異戊酸含量的大小順序?yàn)镚R-T>BL-T>FD-T>Control。

表2 各發(fā)酵體系不同發(fā)酵時(shí)間短鏈脂肪酸濃度表 μg·mL-1

備注：不同小寫字母表示同列的數(shù)據(jù)差異顯著，<0.05

Note: Mean value with different lowercase letters in the same column was significantly different (<0.05)

由此可以得出，綠茶、紅茶和茯磚茶不僅都能提高發(fā)酵體系中總短鏈脂肪酸含量，還能分別提高乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸和戊酸的含量。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，綠茶對乙酸、丙酸、異丁酸、異戊酸、戊酸和總短鏈脂肪酸的提高效果最佳，而茯磚茶對丁酸的提高效果最好。

2.3 不同時(shí)間段發(fā)酵液中腸道微生物的變化

2.3.1 主要腸道微生物菌群數(shù)量的變化

本研究根據(jù)益生元指數(shù)PI值和B/E值的計(jì)算公式，采用傳統(tǒng)選擇性培養(yǎng)基，對兩公式涉及的腸道微生物進(jìn)行分別培養(yǎng)計(jì)數(shù)，即體外發(fā)酵過程中的雙歧桿菌、乳酸桿菌、擬桿菌、梭狀芽孢桿菌、腸桿菌和總厭氧菌，這6類菌數(shù)量變化規(guī)律如圖2-A—F所示。

由圖2可知，與腸桿菌、乳桿菌和梭狀芽孢桿菌數(shù)相比，擬桿菌和雙歧桿菌是主要的優(yōu)勢?？倕捬蹙鷶?shù)量不等于腸桿菌、乳桿菌、梭狀芽孢桿菌、擬桿菌和雙歧桿菌之和，因?yàn)槟c道菌群種類豐富，且很多種類無法通過傳統(tǒng)方法進(jìn)行培養(yǎng)。

由圖2-A可知，添加茶葉水提物的發(fā)酵體系中雙歧桿菌數(shù)量都在12?h時(shí)達(dá)到最高，綠茶、紅茶、茯磚茶的分別為(7.83±0.04)?lgCFU·mL-1、(7.31±0.05)?lgCFU·mL-1、(7.96±0.10)?lgCFU·mL-1，隨后緩慢下降；而對照組的雙歧桿菌數(shù)量最大值出現(xiàn)在8?h階段為(6.16±0.04)?lgCFU·mL-1，隨后大幅度下降。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，試驗(yàn)組中綠茶組、紅茶組、茯磚茶組的雙歧桿菌數(shù)分別為(7.56±0.02)?lgCFU·mL-1、(7.27±0.04)?lgCFU·mL-1、(7.61±0.08)?lgCFU·mL-1，均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于空白對照組的(5.68±0.05)?lgCFU·mL-1。由此看出3種茶水提物對雙歧桿菌的生長有明顯的促進(jìn)增殖的作用，且能延長雙歧桿菌的對數(shù)生長期。同時(shí)，不同茶水提物對雙歧桿菌生長的影響作用存在顯著性差異，發(fā)酵12~24?h階段對雙歧桿菌生長促進(jìn)作用的大小規(guī)律為：FD-T>GR-T>BL-T，該規(guī)律與丁酸產(chǎn)量的規(guī)律一致。

由圖2-B可知，與對照組相比，整個(gè)發(fā)酵過程中，紅茶組乳桿菌數(shù)在前8h階段迅速增長，12?h略有回落，但紅茶組始終促進(jìn)乳桿菌的生長，大于對照組的乳桿菌數(shù)；綠茶組在發(fā)酵前8?h均促進(jìn)乳桿菌生長，但12?h階段乳桿菌數(shù)小于對照組，在24?h時(shí)又大幅度高于其他3組；茯磚茶組發(fā)酵過程中一直呈上升趨勢，沒有出現(xiàn)回落現(xiàn)象，但直到發(fā)酵結(jié)束的24?h，其乳桿菌數(shù)還比對照組小。由此得出，在24?h體外互作的過程中，紅茶、綠茶總體呈促進(jìn)乳桿菌增長的趨勢，而茯磚茶不能促進(jìn)乳桿菌生長。

由圖2-C可知，與對照組相比，整個(gè)發(fā)酵過程中所有試驗(yàn)組都能抑制擬桿菌的生長，其抑制作用的大小規(guī)律為GR-T>BL-T>FD-T，其與發(fā)酵結(jié)束后總短鏈脂肪酸、乙酸和異戊酸含量大小規(guī)律一致。由圖2-D可知，與對照組相比，整個(gè)發(fā)酵過程中所有試驗(yàn)組都能抑制腸桿菌的生長，其抑制作用的大小規(guī)律為FD-T>GR-T>BL-T。由圖2-E可知，與對照組相比，整個(gè)發(fā)酵過程中所有試驗(yàn)組都能抑制梭狀芽孢桿菌的生長，其抑制作用的大小規(guī)律為FD-T>GR-T>BL-T，與對腸桿菌的抑制作用一致。由圖2-F可知，各茶的水提物對總厭氧菌在各時(shí)間段呈現(xiàn)的抑制或促進(jìn)作用不一樣，但在發(fā)酵結(jié)束時(shí)均呈促進(jìn)作用，其中促進(jìn)作用大小規(guī)律為FD-T>BL-T>GR-T。

綜上所述，不同茶水提物都可以明顯增加體外厭氧發(fā)酵體系中雙歧桿菌的數(shù)量，其中茯磚茶的促進(jìn)作用最大；都能明顯抑制擬桿菌、腸桿菌和梭狀芽孢桿菌的數(shù)量，綠茶對擬桿菌的抑制作用最大，而茯磚茶對腸桿菌和梭狀芽孢桿菌的抑制作用最大；但對乳桿菌紅茶和綠茶組呈促進(jìn)作用，茯磚茶呈抑制作用；3種茶水提物對總厭氧菌不同時(shí)間段呈現(xiàn)出不同的促進(jìn)或抑制作用。因此，綠茶、紅茶和茯磚茶水提物都能調(diào)節(jié)腸道菌群的結(jié)構(gòu)組成，促進(jìn)腸道菌群平衡。

2.3.2 PI和B/E

將圖2中的數(shù)據(jù)帶入益生元指數(shù)PI和B/E的計(jì)算公式，將計(jì)算結(jié)果做成直觀的折線圖，PI值如圖3所示，B/E值如圖4所示。

Palframan等[18]提出益生元指數(shù)（Prebiotic index，PI），其是用作衡量低聚果糖益生元作用的指標(biāo)，借此避免因取樣接種不均衡、初始菌數(shù)量和總菌數(shù)量不一致所導(dǎo)致的試驗(yàn)結(jié)果偏差。本研究借鑒使用益生元指數(shù)PI，用以評價(jià)不同茶葉水提物的益生作用。由圖3可知，試驗(yàn)組的益生元指數(shù)PI均在12?h階段達(dá)到最大值，且空白組益生元指數(shù)在體外發(fā)酵過程的各個(gè)時(shí)間段顯著低于試驗(yàn)組，說明3種茶葉水提物的添加，都在體外發(fā)酵系統(tǒng)中表現(xiàn)出益生作用。其中4?h階段茯磚茶組的益生元指數(shù)最大，而發(fā)酵8、12、24?h階段益生元指數(shù)綠茶組最大。

注：不同小寫字母表示同一時(shí)間數(shù)據(jù)差異顯著，P<0.05

注：不同小寫字母表示同一時(shí)間數(shù)據(jù)差異顯著，P<0.05

B/E＞1表示該腸道菌群體系中雙歧桿菌數(shù)量高于腸桿菌，可改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，有利腸道有益菌定殖；B/E＜1表示該腸道菌群體系中雙歧桿菌數(shù)量低于腸桿菌，無特殊改善腸道菌群作用。由圖4可知，空白組的B/E值均小于1，說明沒有添加茶葉水提物的基礎(chǔ)發(fā)酵液體系中雙歧桿菌沒能形成優(yōu)勢菌。而所有試驗(yàn)組的B/E值在同一發(fā)酵時(shí)間遠(yuǎn)大于空白組，B/E值在各發(fā)酵體系的大小規(guī)律為：FD-T>GR-T>BL-T>Control，說明3種茶均能夠改善腸道菌群結(jié)構(gòu)。

3 討論

茶葉中含有大量活性物質(zhì)，長期以來，茶葉的減肥、降血糖、增強(qiáng)免疫、抑制癌細(xì)胞增殖，甚至是調(diào)節(jié)相關(guān)代謝性疾病等功能活性受到人們的廣泛關(guān)注[21-23]。隨著研究的深入，學(xué)者們逐漸發(fā)現(xiàn)茶葉中多酚和多糖對腸道微生物的調(diào)節(jié)可能是茶葉發(fā)揮其活性主要作用的靶點(diǎn)之一[24]。研究發(fā)現(xiàn)，3種茶的水提物都能大幅度提高短鏈脂肪酸的產(chǎn)量，促進(jìn)有益菌的生長，同時(shí)抑制有害菌的生長，但綠茶、紅茶和茯磚茶由于制作工藝的差異，其營養(yǎng)物質(zhì)成分也有差異，因此其功效上也有著各自的特點(diǎn)，這一研究結(jié)果與劉平等[25]、傅冬和等[22]、岳隨娟等[26]和郭虹雯等[27]的研究結(jié)論一致。

24?h體外發(fā)酵過程中，綠茶、紅茶和茯磚茶3種茶水提物都能顯著降低發(fā)酵體系的pH值，其中FD-T組茯磚茶發(fā)酵體系下降幅度顯著大于GR-T組綠茶發(fā)酵體系和BL-T組紅茶發(fā)酵體系。綠茶、紅茶和茯磚茶3種茶水提物都能顯著提高發(fā)酵體系中總短鏈脂肪酸的含量，發(fā)酵前12?h的總短鏈脂肪酸含量變化與pH值變化規(guī)律相符；但24?h階段FD-T組茯磚茶發(fā)酵體系中pH值最低，而此時(shí)總短鏈脂肪酸含量卻遠(yuǎn)小于GR-T組綠茶發(fā)酵體系和BL-T組紅茶發(fā)酵體系，出現(xiàn)這一矛盾，可能在茯磚茶發(fā)酵體系中存在有機(jī)酸等代謝產(chǎn)物，如乳酸等有機(jī)酸的存在也會(huì)影響發(fā)酵體系的pH值，謝旻皓等[28]就同時(shí)研究了苦丁茶發(fā)酵體系中乳酸的含量，因此本研究各發(fā)酵體系中的有機(jī)酸含量值得進(jìn)一步研究探討。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)3種茶葉水提物發(fā)酵體系中的主要短鏈脂肪酸都是乙酸、丙酸和丁酸，且3種茶葉水提物都不僅能明顯提高乙酸、丙酸和丁酸含量還能提高異丁酸、異戊酸和戊酸含量。乙酸能作為周邊組織的能源，參與肌肉、心臟、肝臟和腦內(nèi)的代謝活動(dòng)，還是膽固醇合成的主要底物，有著重要的生理功能[29]。丙酸也有著重要的生理功能，研究表明其能抑制膽固醇的合成，降低血糖和胰島素水平，調(diào)節(jié)碳水化合物和脂肪代謝[30]。丁酸被譽(yù)為最重要短鏈脂肪酸之一，被充分證實(shí)的還有抗炎證、抗癌變效果，基于丁酸在維持腸道健康過程中所起的作用，甚至有研究者認(rèn)為新型益生元的設(shè)計(jì)要尋找可以提高丁酸產(chǎn)量的營養(yǎng)物質(zhì)[31]。說明3種茶葉水提物都能提高短鏈脂肪酸的含量，有利于調(diào)節(jié)人體身體健康，但綠茶對乙酸、丙酸、異丁酸、異戊酸、戊酸和總短鏈脂肪酸的提高效果最佳，而茯磚茶對丁酸的提高效果最好。

此外，本研究采用健康青年人體糞便作為菌源能真實(shí)反映人體腸道微生物結(jié)構(gòu)組成，模擬腸道環(huán)境的體外發(fā)酵系統(tǒng)這種模式快捷、方便，能在一定程度上反映腸道菌群的變化規(guī)律，且這種方法也逐漸成為人們研究腸道微生物與膳食因子互作的常用方法，如Palframan等[18]、Vernazza等[32]、Sanchez-Patan等[33]、吳根梁等[24]、Zhang等[20]和謝旻皓等[28]國內(nèi)外學(xué)者都采用了體外發(fā)酵系統(tǒng)的模式。本研究發(fā)現(xiàn)3種茶水提物都可以明顯增加體外厭氧發(fā)酵體系中雙歧桿菌的數(shù)量，特別是茯磚茶的促進(jìn)作用最大，這與其發(fā)酵體系中pH值最低的結(jié)果相符。3種茶葉水提物都能明顯抑制擬桿菌、腸桿菌和梭狀芽孢桿菌的數(shù)量；綠茶對擬桿菌的抑制作用最大，而茯磚茶對擬桿菌的抑制效果有限；但茯磚茶對腸桿菌和梭狀芽孢桿菌的抑制作用最大；這些結(jié)果與吳根梁等[24]、劉平等[25]對茯磚茶的研究結(jié)果一致。值得特別關(guān)注的是，我們發(fā)現(xiàn)紅茶和綠茶組對乳桿菌呈促進(jìn)作用，但茯磚茶則呈一定的抑制作用，一方面與茯磚茶發(fā)酵體系中雙歧桿菌和擬桿菌的數(shù)量較多有關(guān)，另一方面可能與茯磚茶水提物中含有金花菌相關(guān)成分有關(guān)，還值得進(jìn)一步探究。

資料顯示，人的胃腸道棲息著約30多個(gè)屬500多種細(xì)菌，主要由厭氧菌和兼性厭氧菌組成，其中專性厭氧菌占99%以上[34]。因此，本研究PI指數(shù)公式中的總菌數(shù)以總厭氧菌數(shù)計(jì)。通過計(jì)算PI值，說明3種茶的水提物對人體都有明顯的益生作用，4?h階段茯磚茶組的益生元指數(shù)最大，而發(fā)酵8、12、24?h階段益生元指數(shù)綠茶組最大。通過計(jì)算B/E值，說明3種茶水提物對人體都有明顯的益生作用，但茯磚茶組的B/E最大，益生效果最明顯。此外，膳食益生效果的評價(jià)還有其他指標(biāo)，如郭虹雯等[27]通過F/B值（厚壁菌門/擬桿菌門）研究綠茶對肥胖的影響作用，Jelena等[35]以益生元效果指數(shù)（Measurement of prebiotic effect，MPE）評價(jià)膳食因子的益生效果，這些指數(shù)我們都可以借鑒。同時(shí)，由于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法本身的局限，糞便中還存在大量未被培養(yǎng)的腸道微生物，且傳統(tǒng)培養(yǎng)計(jì)數(shù)操作繁瑣，工作量大，培養(yǎng)效率和精準(zhǔn)性都有待提高，且各種茶水提物對腸道微生物多樣性的影響作用無法體現(xiàn)，后續(xù)還可進(jìn)一步通過高通量測序來探究3種茶水提物與腸道微生物的互作效應(yīng)。

因此，通過以上研究和分析得出，青年人適當(dāng)飲用綠茶、紅茶和茯磚茶都可以調(diào)節(jié)身體健康，3種茶水提物與對照組相比均會(huì)引起腸道環(huán)境pH值的大幅下降；都能顯著增加短鏈脂肪酸的產(chǎn)量，調(diào)節(jié)腸道微生物的結(jié)構(gòu)組成，促進(jìn)雙歧桿菌的增長，抑制擬桿菌、腸桿菌和梭狀芽孢桿菌的生長；且通過分析PI值和B/E值，發(fā)現(xiàn)綠茶、紅茶和茯磚茶組都具有良好的益生作用。但由于3種茶葉的制作工藝和營養(yǎng)物質(zhì)成分的差異，其與腸道微生物互作效應(yīng)又有各自特點(diǎn)；其中茯磚茶組pH值下降幅度最大，對短鏈脂肪酸中丁酸的提高效果最佳，對雙歧桿菌的促進(jìn)作用最好，對腸桿菌和梭狀芽孢桿菌的抑制效果最明顯，發(fā)酵4?h階段的益生元指數(shù)PI值最大，且整個(gè)發(fā)酵過程的B/E均保持最大；綠茶組對乙酸、丙酸、異丁酸、異戊酸、戊酸和總短鏈脂肪酸的提高效果最佳，對擬桿菌的抑制效果最好，發(fā)酵8、12、24?h階段的益生元指數(shù)PI值最大；但綠茶組和紅茶組都能促進(jìn)乳桿菌的增殖，茯磚茶組卻表現(xiàn)出抑制作用。本研究模擬腸道系統(tǒng)進(jìn)行體外厭氧發(fā)酵，使不同茶的水提物直接與糞便微生物作用，而實(shí)際飲茶過程，茶葉部分營養(yǎng)成分會(huì)在小腸段被吸收利用，因此在人體中是否出現(xiàn)同樣的功效還有待進(jìn)一步深入研究和驗(yàn)證。

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Effects of Green, Black and Fu Brick Tea AqueousExtracts on the Characteristics of Intestinal Microbiota duringFermentation

HOU Aixiang1,3, YAN Daomin2, SUN Jingwen4, ZHENG Xu1, LI Saidan4*, XIAO Runhua4, BEI Shuang4

1. Food Science and Technology College of Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2. International College of Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 3. National Engineering Center of Plant Functional Components Utilization, Changsha 410128, China; 4. Orient Science and Technology of Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China

In order to demonstrate the interaction effect of different tea aqueous extracts and intestinal microorganisms, anaerobic fermentationby the intestinal bacteria from healthy college students’ feces were conducted in this study. Traditional culture techniques and gas chromatography technology were employed to study the changes of pH, short-chain fatty acids and intestinal microbes in different tea aqueous extracts (green, black and Fu brick tea) during 24?h offermentation, and calculate the prebiotic index PI and B/E values ().The results show that the tea aqueous extracts significantly decreased the pH value compared with the blank control group, and the biggest drop was identified in the Fu brick tea group. Besides, the tea aqueous extracts significantly increased the production of short-chain fatty acids. Green tea had the largest increase in acetic acid, propionic acid, isobutyric acid, iso-pentanoic acid, pentanoic acid and total short-chain fatty acids, while Fu brick tea had the largest increase in butyric acid. All three kinds of tea aqueous extracts could affect the composition of intestinal microorganisms, promoted the growth ofand inhibited the growth of,and. Fu brick tea group had the largest promoting effect on, had the most obvious inhibiting effect onand, and green tea group had the largest inhibiting effect on. However, both green and black tea groups could promote the growth of, while Fu brick tea group showed inhibition ofgrowth. In addition, by analyzing PI value and B/E value, It was found that green, black and Fu brick teas had the function as probiotics. The largest PI value at the 4?h stage appeared in fu brick tea, while the largest PI value at the 8?h, 12?h and 24?h stages appeared in green tea. the largest B/E value throughout the fermentation process appeared in Fu brick tea group. This study provided basic data and scientific basis for the further expansion and promotion of different teas in the youth consumption market.

green tea, black tea, Fu brick tea,fermentation, short-chain fatty acid, intestinal microbiota

TS272

A

1000-369X(2019)04-403-12

2018-07-04

2018-09-07

國家自然科學(xué)基金（31701606）

侯愛香，女，博士研究生，主要從事食品生物技術(shù)研究。*通信作者：1758231594@qq.com