吳孔陽　李婉婉　楊同香　杜如月　楊嬈

摘要：從環(huán)境樣品中篩選得到1株耐高溫纖維素酶產(chǎn)生菌A13。形態(tài)及生理生化特征測定結(jié)果表明，A13菌株與芽孢桿菌屬（Bacillus）中地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）的特征基本一致。測定了該菌株的16S rDNA序列并根據(jù)16S rDNA構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，在系統(tǒng)發(fā)育樹中，A13菌株與地衣芽孢桿菌形成一個(gè)類群，序列同源性為90%。最終確定該菌株為地衣芽孢桿菌。

關(guān)鍵詞：耐高溫;產(chǎn)纖維素酶菌株;分離;形態(tài)學(xué)鑒定;分子生物學(xué)鑒定;系統(tǒng)發(fā)育樹

中圖分類號： S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）09-0312-03

當(dāng)煤、石油等不可再生資源逐漸短缺甚至枯竭時(shí)，資源便成了全球共同面臨的重大問題。纖維素是最豐富的有機(jī)物質(zhì)，是地球上最廣泛最豐富的自然資源和可再生資源之一[1]，每年纖維素的產(chǎn)量都高達(dá)2 000億t，但是纖維素難以被分解利用，不僅不能更好地為人類所用，反而還會(huì)造成浪費(fèi)甚至導(dǎo)致環(huán)境污染。自1906年纖維素酶在蝸牛消化道內(nèi)被發(fā)現(xiàn)以來，學(xué)術(shù)界開始普遍采用微生物去降解纖維素[2]。纖維素酶不是單一成分的酶，而是一類復(fù)雜的復(fù)合物，是由多種酶協(xié)同起作用的多酶體系，能夠?qū)⒗w維素降解為葡萄糖[3]，因此在纖維素酶的作用下降解纖維素不僅可以為全球的能源供應(yīng)作出貢獻(xiàn)，同時(shí)還能有效解決廢棄物處理等一系列問題[4]。

纖維素酶產(chǎn)生菌得到學(xué)術(shù)界的廣泛研究，僅被記錄在Swiss Protein數(shù)據(jù)庫中的纖維素酶氨基酸序列就已經(jīng)達(dá)到649條，基因序列共有433條[5]，但是從微生物中篩選出的產(chǎn)纖維素酶菌株的產(chǎn)酶能力低且熱穩(wěn)定性較差，真正高產(chǎn)的微生物菌株相對較少，纖維素酶的生產(chǎn)依舊處于高成本低產(chǎn)量的狀態(tài)，纖維素酶產(chǎn)生菌的選育依然是今后研究的一個(gè)重要方向。本研究擬從環(huán)境樣品中分離篩選產(chǎn)纖維素酶菌株，并對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，以期能夠得到1株耐高溫的產(chǎn)纖維素酶菌株，為相關(guān)基礎(chǔ)研究提供相應(yīng)的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 試驗(yàn)用樣品采集自生活污泥堆肥。

1.1.2 培養(yǎng)基

纖維素分離培養(yǎng)基：酵母粉5.0 g/L，羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）10.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，瓊脂20.0 g/L，MgSO4 0.2 g/L，KH2PO4 1.0 g/L，115 ℃ 滅菌30 min。葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基：蛋白胨 0.5 g/L，K2HPO4 0.2 g/L，葡萄糖0.5 g/L，pH值7.2～7.4。吲哚產(chǎn)生試驗(yàn)培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，胰蛋白胨10.0 g/L，pH值7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min。檸檬酸鹽利用試驗(yàn)培養(yǎng)基：MgSO4 0.2 g/L，檸檬酸鈉2.0 g/L，（NH4）2HPO4 1.0 g/L，瓊脂15.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，1%溴百里香酚藍(lán)水溶液10.0 g/L，pH值6.8～7.0，115 ℃滅菌20 min。

1.1.3 主要試劑

葡萄糖、四水酒石酸鈉、3、5-二硝基水楊酸、苯酚、無水亞硫酸鈉、羧甲基纖維素鈉、無水乙醇、剛果紅、NaCl、溴甲酚紫指示劑、甲基紅、乙醚、吲哚等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離

用電子天平準(zhǔn)確稱取5 g采集的樣品加入到燒杯中，同時(shí)向燒杯中加入45 mL無菌水，然后把燒杯放置于沸水中水浴處理10 min，將處理過的燒杯放在130 r/min的搖床培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)30 min，取20 μL振蕩培養(yǎng)后的懸液，用移液槍涂布到新的纖維素分離培養(yǎng)基中，最后將培養(yǎng)基倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～22 h。待培養(yǎng)基中長出菌落后，將培養(yǎng)基以及所需試驗(yàn)材料放置于超凈工作臺中，在紫外燈下照射20 min，然后用無菌牙簽挑取適量的菌株，分別點(diǎn)接到新的纖維素分離培養(yǎng)基上，并為各菌株編號，將點(diǎn)接過菌株的纖維素分離培養(yǎng)基倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng) 18～22 h。待培養(yǎng)基中長出菌落后，把適量的剛果紅溶液（1 mg/mL）倒入培養(yǎng)基中，要保證剛果紅溶液能夠完全蓋住培養(yǎng)基表面，將培養(yǎng)基靜置染色1 h后倒出剛果紅溶液，再用蒸餾水進(jìn)行反復(fù)清洗，直至流出的液體無紅色為止，最后用適量NaCl溶液（1 mol/L）浸泡洗脫30 min，倒出NaCl溶液。

觀察菌株周圍能否產(chǎn)生透明圈，以菌株產(chǎn)生的透明圈直徑和菌落直徑的比值作為初步判斷纖維素分解能力的指標(biāo)，并將比值較大的菌株單獨(dú)重新點(diǎn)接到新的纖維素分離培養(yǎng)基上，持續(xù)培養(yǎng)18～22 h，之后同樣進(jìn)行剛果紅溶液染色、NaCl溶液浸泡洗脫等步驟，最后用游標(biāo)卡尺準(zhǔn)確測量菌株周圍透明圈的直徑和菌落直徑，并計(jì)算兩者的比值。

1.2.2 菌株的鑒定

對經(jīng)過篩選得到的產(chǎn)纖維素酶菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和一系列生理生化鑒定，在參照《伯杰氏細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[6-7]（中文第8版）和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》的基礎(chǔ)上，對菌株進(jìn)行鑒定。

把菌株接種到葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，然后將培養(yǎng)基放置于37 ℃、160 r/min的搖床培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)18～22 h，待液體培養(yǎng)基中出現(xiàn)渾濁后，取1.5 mL培養(yǎng)液于離心管進(jìn)行離心，用于提取菌株的基因組DNA。以所提取到的基因組DNA為模板，采用細(xì)菌通用引物27F和1492R，利用PCR擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增16S rDNA。

擴(kuò)增的基本程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性45 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸 10 min[8]。取5 μL擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物置于PCR管中，隨后進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，之后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送往北京中科希林生物科技有限責(zé)任公司進(jìn)行DNA測序。在NCBI上通過Blast程序?qū)y序結(jié)果進(jìn)行基因同源性的分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹作進(jìn)一步分析。

1.2.3 酶活性測定

根據(jù)國際單位制，將單位時(shí)間內(nèi)1 mL酶液水解底物所能生成1 μmol葡萄糖的酶量稱為1個(gè)酶活性單位，以U/mL表示[9]。參考文獻(xiàn)[10]繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定纖維素酶活性大小，取0.5 mL離心后的上清液作為粗酶液，加入含有0.625%羧甲基纖維素鈉、pH值為4.4的緩沖液2 mL，置于50 ℃水浴鍋中酶解0.5 h，然后加入 2.5 mL 二硝基水楊酸（DNS）顯色液于沸水浴中加熱5 min，待冷卻后在540 nm處測吸光度。纖維素酶活性計(jì)算公式：

纖維素酶活性=m×1/V×n。

式中：m表示葡萄糖含量，mg;V表示所用酶液量，mL;n表示酶液的稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選結(jié)果

本試驗(yàn)從堆肥樣品中得到耐高溫菌株共18株，記為 A1～A18，最終篩選出能產(chǎn)纖維素酶的菌株共14株，將分離出來的菌株進(jìn)行剛果紅染色，其中產(chǎn)生透明圈直徑與菌落直徑比值較大的菌株有8株（表1）。透明圈直徑與菌落直徑的比值越大，說明菌株產(chǎn)纖維素酶的活力就越強(qiáng)。由表1可知，A13菌株透明圈直徑與菌落直徑的比值最大，其產(chǎn)纖維素酶的活力最強(qiáng)，菌株A13剛果紅染色結(jié)果如圖1所示，最終選擇菌株A13進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 酶活性測定

利用DNS法測定不同濃度的葡萄糖溶液在540 nm處的吸光度，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，其標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.397 4x+0.010 8，r2=0.997 9，表明D540 nm與葡萄糖濃度之間呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，因此可以通過該方程和酶活性計(jì)算公式得出菌株A13的纖維素酶活性，達(dá)到9.27 U/mL。

2.3 菌株鑒定

2.3.1 菌株的形態(tài)鑒定

耐高溫纖維素酶菌株A13在平板上的形態(tài)特征見圖2，在光學(xué)顯微鏡下的觀察結(jié)果見圖3，菌落特征及革蘭氏染色的情況見表2。

2.3.2 生理生化鑒定結(jié)果

對所篩選得到的菌株A13進(jìn)行甲基紅試驗(yàn)、乙酰甲基甲醇試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)和檸檬酸鹽利用試驗(yàn)等一系列生理生化鑒定，結(jié)果見表3，通過對菌株形態(tài)特征及其所具有生理生化特征的鑒定，并對照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》（中文第8版）和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》，初步將菌株A13鑒定為芽孢桿菌屬。

2.3.3 菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析

以菌株A13的基因組DNA作為模板對16SrDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在瓊脂糖凝膠電泳圖上觀察到1條大小為1 500 bp左右的特異性條帶（圖4）。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至測序公司進(jìn)行DNA測序，并將所得序列提交到NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行同源DNA序列的比對分析。結(jié)果（圖5）表明，菌株A13的16S rDNA序列與地衣芽孢桿菌[Bacillus licheniformis strain K1（KU922430.1）]等具有90%的相似程度，菌株A13與Bacillus licheniformis的遺傳距離最近，結(jié)合菌株A13形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征以及系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果，將菌株A13鑒定為地衣芽孢桿菌。

3 結(jié)論與討論

纖維素酶可用于降解天然纖維素，是將資源合理利用的一種方式[11]。隨著科技的發(fā)展，纖維素酶在各行各業(yè)中的市場需求量增大，例如在飼料、釀酒、制藥、食品、造紙、紡織、環(huán)保、石油開采等行業(yè)中，纖維素酶都具有舉足輕重的地位。但是由于纖維素酶發(fā)酵活力較低、生產(chǎn)成本高以及耐熱性不高等原因，纖維素酶并不能被普遍應(yīng)用于所需的生產(chǎn)實(shí)踐中，進(jìn)而使纖維素酶的發(fā)展受到了一定的限制。因此有必要進(jìn)一步尋找更多成本低、催化性能高的纖維素酶。王巍杰等通過響應(yīng)面法優(yōu)化地衣芽孢桿菌發(fā)酵樹葉飼料時(shí)的纖維素酶活性，最終優(yōu)化后酶活性達(dá)到6.73 U[12]。余祖華等通過搖瓶發(fā)酵優(yōu)化地衣芽孢桿菌B. LY02產(chǎn)纖維素酶的條件，產(chǎn)酶活性達(dá)到了0.683 5 U/mL[13-14]。

本試驗(yàn)初步分離得到14株具有產(chǎn)纖維素酶能力的菌株，經(jīng)測定最終篩選出1株酶活性最高的菌株A13，結(jié)合菌株的形態(tài)特征、生理生化特征以及對系統(tǒng)發(fā)育樹的分析結(jié)果，最終將菌株鑒定為地衣芽孢桿菌，其酶活性為9.27 U/mL，后期通過誘變選育和發(fā)酵條件優(yōu)化有望進(jìn)一步提高其產(chǎn)纖維素酶活力。

參考文獻(xiàn)：

[1]Lynd L R，Weimer P J，van Zyl W H，et al. Microbial cellulose utilization：fundamentals and biotechnology[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews：MMBR，2002，66（3）：506-577.

[2]穆春雷，武曉森，李術(shù)娜，等. 低溫產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選，鑒定及纖維素酶學(xué)性質(zhì)[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，2013，40（7）：1193-1201.

[3]李素芬，霍貴成. 纖維素酶的分子結(jié)構(gòu)組成及其功能[J]. 中國飼料，1997（13）：12-14.

[4]王洪媛，范丙全. 三株高效秸稈纖維素降解真菌的篩選及其降解效果[J]. 微生物學(xué)報(bào)，2010，50（7）：870-875.

[5]顧方媛，陳朝銀，石家驥，等. 纖維素酶的研究進(jìn)展與發(fā)展趨勢[J]. 微生物學(xué)雜志，2008，28（1）：83-87.

[6]任世英，邵 奎，李 雯，等. 一株耐高溫纖維素酶產(chǎn)生菌的分離和鑒定[J]. 工業(yè)微生物，2016，46（4）：19-24.

[7]東秀珠，蔡妙英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]. 北京：科學(xué)出版社，2001.[HJ1.74mm]

[8]龔麗瓊，鄧朝霞，黃祖新，等. 高溫大曲中篩選產(chǎn)纖維素酶的耐高溫芽孢桿菌[J]. 福建師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2012，28（3）：106-112.

[9]陳紅漫，楊會(huì)穎，蔡金濤，等. 一株耐熱纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選及酶學(xué)特性[J]. 生物技術(shù)，2010，20（4）：58-61.

[10]江國忠. 高產(chǎn)纖維素酶枯草芽孢桿菌的篩選、應(yīng)用及其產(chǎn)酶條件研究[D]. 南昌：南昌大學(xué)，2010.

[11]劉潔麗，王 靖. 生物產(chǎn)纖維素酶研究進(jìn)展[J]. 化學(xué)與生物工程，2008，25（12）：9-12.

[12]王巍杰，王勝春，尹 丹. 響應(yīng)面法優(yōu)化地衣芽孢桿菌發(fā)酵樹葉飼料提高纖維素酶活力的研究[J]. 飼料工業(yè)，2012，33（17）：11-14.

[13]余祖華，丁 軻，侯 奎，等. 產(chǎn)纖維素酶地衣芽孢桿菌B.LY02搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 河南科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2016，37（4）：76-80.

[14]余祖華，丁 軻，侯 奎，等. 產(chǎn)纖維素酶地衣芽孢桿菌的誘變選育及其產(chǎn)酶條件優(yōu)化[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2016，43（4）：1006-1011.