徐小波　嚴(yán)敏　歐正銓　任憲路　師蔚群

摘要：為了解進(jìn)口豬精液常溫保存稀釋粉的實(shí)際應(yīng)用效果，選購市場上常見的6種進(jìn)口稀釋粉進(jìn)行比較試驗(yàn)。結(jié)果表明：隨著常溫保存時(shí)間的延長，不同稀釋粉組間，活力下降速度存在差異，其中DILTEC和CXM下降最快，PRIMXCELL組下降最慢。精子有效存活時(shí)間差異很大，由長到短的順序?yàn)镻RIMXCELL>ACTIYE>XINZUAN>SpermPro>CXM>DILTEC;總存活時(shí)間也是PRIMXCELL最長，達(dá)到384 h以上;保存120 h頂體完整率存在顯著差異，從高到低順序?yàn)镻RIMXCELL>SpermPro>XINZUAN>ACTIYE>CXM>DILTEC。說明法國的PRIMXCELL稀釋粉最好，有效存活時(shí)間242 h，總存活時(shí)間384 408 h，保存120 h頂體完整率79.6%。

關(guān)鍵詞：公豬精液;稀釋粉;常溫保存;精子活力;頂體完整率

中圖分類號(hào)： S814.3;S828.3+4文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）09-0201-03

1956年英國學(xué)者Polge成功地將豬人工授精技術(shù)從試驗(yàn)研究應(yīng)用于養(yǎng)豬生產(chǎn)實(shí)踐，但直到20世紀(jì)80年代這項(xiàng)技術(shù)才真正在養(yǎng)豬生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用[1]。我國豬人工授精推廣較晚，且外種豬引進(jìn)（造成發(fā)情鑒定不準(zhǔn)確）等原因嚴(yán)重影響了本項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展。一些養(yǎng)豬發(fā)達(dá)國家人工授精的普及率在90%以上[2-3]，我國豬人工授精的比例在40%左右，規(guī)模豬場的比例達(dá)85%。雖然豬冷凍精液能實(shí)現(xiàn)豬精液的長期保存，但其技術(shù)相對(duì)復(fù)雜、成本高且受胎率低，所以99%以上采用常溫保存精液來實(shí)施豬人工授精[4]。豬精液的活力保存是人工授精的重要環(huán)節(jié)，其中稀釋粉的配制是保證精子質(zhì)量的關(guān)鍵因素之一。國外稀釋粉研究較早，保存效果相對(duì)較好，目前常見的進(jìn)口稀釋粉有丹麥的亞衛(wèi)、比利時(shí)的CMX、美國的VIM、西班牙BIO、法國卡蘇BTS等，進(jìn)口稀釋粉種類多，價(jià)格貴，效果差別較大。為篩選出優(yōu)秀的進(jìn)口稀釋粉，本研究挑選出市售常見的6種進(jìn)口稀釋粉進(jìn)行效果比較，以期為豬人工授精的推廣應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 稀釋粉

選購市場上常見的6種進(jìn)口稀釋粉（法國PRIMXCELL、荷蘭SpermPro、丹麥ACTIYE、西班牙DILTEC、比利時(shí)CXM和韓國XINZUAN）進(jìn)行比較試驗(yàn)。

1.2 公豬精液

試驗(yàn)用精液來源于徐州惠牧種畜禽有限公司18月齡的健康大約克種豬，于2017年5月共4次采集同一頭公豬精液（公豬號(hào)HM15385），手握法采精，收集中段精子含量高的部分（丟棄射精開始與結(jié)束時(shí)精清含量高的部分）精液，每次采精結(jié)束10 min內(nèi)用豬精子質(zhì)量計(jì)算機(jī)檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)原精密度與活力（表1），平均分成6份，準(zhǔn)備稀釋。

1.3 精液的稀釋和保存

在精液稀釋前1 h，將6種不同的稀釋粉按說明書分別用雙蒸水配制成稀釋液，置于37 ℃恒溫水浴中預(yù)熱備用。采集的新鮮精液檢查合格后30 min內(nèi)完成稀釋，根據(jù)精液密度確定稀釋倍數(shù)（稀釋終密度為3.5×107個(gè)/mL），保證80～100 mL 稀釋精液中含有效精子數(shù)30×108個(gè)左右。稀釋前將稀釋液的溫度調(diào)至與精液溫度之差小于1 ℃，將稀釋好的精液分裝在10 mL青霉素瓶中做好6種不同標(biāo)記并編號(hào)，用多層毛巾覆蓋在室溫中緩慢降溫，3～4 h后置于17 ℃的恒溫箱中保存。保存過程中每隔12 h輕輕翻動(dòng)1次，防止精子在瓶底沉淀時(shí)間過長，影響活力保存。

1.4 精子活力檢查

每隔24 h，從6種稀釋精液中各取出1瓶輕輕搖勻后置于37 ℃水浴中預(yù)熱2 min，取中層精液10 μL涂片，用豬精子質(zhì)量計(jì)算機(jī)檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)精子活力變化。

1.5 頂體完整率

于稀釋后保存120 h，使用南京建成精子快速染色試劑盒按程序?qū)舆M(jìn)行涂片染色，在1 000倍光學(xué)顯微鏡下觀察統(tǒng)計(jì)頂體完整率（即頂體完整的精子所占總精子的比例）。

1.6 數(shù)據(jù)處理

精子活力及頂體完整率檢測(cè)均采用多視野（3個(gè)以上）平均值，用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用SPSS 18.0進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同豬精液稀釋粉在稀釋過程中對(duì)精子活力的影響

6種稀釋粉稀釋后的精液，精子活力均有所下降（表2），其中西班牙的DILTEC和比利時(shí)的CXM下降幅度較大（P<0.05），其次是法國的PRIMXCELL和丹麥的ACTIYE（P<0.05），荷蘭的SpermPro下降幅度較?。≒<0.05），韓國的XINZUAN下降最?。≒<0.05）。說明不同的稀釋粉，在稀釋過程中對(duì)精子的應(yīng)激損傷程度有差異。

2.2 不同豬精液稀釋粉對(duì)精子常溫保存過程中活力的影響

隨著常溫保存時(shí)間的延長，精子活力呈現(xiàn)逐步下降（表3），但不同稀釋粉組間，下降速度存在差異，其中DILTEC和CXM下降較快，PRIMXCELL下降最慢，ACTIYE、SpermPro和XINZUAN下降速度居中且總速度相近，但ACTIYE表現(xiàn)為前期（120 h前）下降速度較快（3組下降速度依次為每天2.56、2.00和2.37百分點(diǎn)），后期（120～360 h）下降速度較慢（3組下降速度依次為每天6.15、6.42、6.89百分點(diǎn)）。

2.3 不同精液稀釋粉對(duì)精子有效存活時(shí)間、總存活時(shí)間和頂體完整率的影響

6種稀釋粉組的有效存活時(shí)間（活力維持在60%以上的存活時(shí)間）在162～242 h差異很大，由長到短的順序?yàn)镻RIMXCELL>ACTIYE>XINZUAN>SpermPro>CXM>DILTEC，PRIMXCELL有效存活時(shí)間最長，DILTEC最短;活力在30%時(shí)的存活時(shí)間在273～353 h之間，由長到短的順序?yàn)镻RIMXCELL>ACTIYE>SpermPro>XINZUAN>CXM>DILTEC，其中ACTIYE、SpermPro和XINZUAN很接近，都在 338 h 左右;總存活時(shí)間也是PRIMXCELL最長，達(dá)到384 h以上，DILTEC最短，只有312 h以上。6種稀釋粉組保存 120 h 頂體完整率存在顯著差異，其中PRIMXCELL最高（79.6%），顯著高于DILTEC最低（69.8%），從高到低順序?yàn)镻RIMXCELL>SpermPro>XINZUAN>ACTIYE>CXM>DILTEC（表4）。

3 討論與結(jié)論

3.1 豬精液稀釋粉及其添加物的作用

豬原精不進(jìn)行適當(dāng)稀釋，在室溫下放置十幾小時(shí)就會(huì)全部失去活力，常溫保存稀釋液提供豬精子存活并保持受精能力所需的能量物質(zhì)及適宜的環(huán)境（pH值和滲透壓等），稀釋液中不同的添加物具有不同的作用，葡萄糖提供能量維持滲透壓，碳酸氫鈉、Tris和檸檬酸鈉提供酸堿環(huán)境，EDTA防止頂體反應(yīng)，谷胱甘肽和褪黑激素保護(hù)質(zhì)膜防止氧化損傷，海藻糖和蔗糖等對(duì)質(zhì)膜和頂體結(jié)構(gòu)有保護(hù)作用，BSA作為蛋白保護(hù)劑則通過穩(wěn)定精子結(jié)構(gòu)等多途徑保護(hù)精子，維生素C和氯丙嗪能抑制或降低精子的運(yùn)動(dòng)，這些添加物的適量使用與合理配合才能最大限度地延長稀釋精液在常溫保存的時(shí)間[5]。蘇澤智等自制的稀釋粉保存5 d的精子活力為63%，頂體完整率78.4%[6]，活力不同程度地低于本試驗(yàn)選的6種進(jìn)口稀釋粉，頂體完整率相當(dāng)。尤如華等選用6種進(jìn)口稀釋粉與自配稀釋粉進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)法國的PRIMXCELL活力保存時(shí)間最長，且自配與進(jìn)口的在保存7 d活力差異不是很大，但之后活力差距迅速拉開[7]，由于其鮮精活力與本研究相比較低，所以保存相同時(shí)間的精子活力和總存活時(shí)間均低于本試驗(yàn)結(jié)果，但其比較與排序結(jié)果基本吻合。

3.2 精子活力、頂體完整率與受精能力

豬人工授精實(shí)踐證明，豬一次正常輸精量為80～100 mL，必須含有25×108個(gè)左右的精子，才能得到較高的受胎率。同時(shí)對(duì)精子活力的要求必須在60%以上，否則受胎率也會(huì)受到嚴(yán)重影響，所以保持60%精子活力的存活時(shí)間才是有意義的存活時(shí)間，并確定為有效存活時(shí)間。另外，精子的頂體含有多種與受精有關(guān)的酶，在頂體穿過透明帶和放射冠中發(fā)揮重要作用，只有頂體完整、有活力的精子才具備受精能力，所以有些形態(tài)正常的精子雖然有活力但不具備受精能力，那是因?yàn)槠漤旙w結(jié)構(gòu)異常所致，同樣一些頂體形態(tài)正常，但精子尾部丟失等精子整體形態(tài)不正常的精子則沒有活力，也不具備受精能力，因此在對(duì)精液受精能力進(jìn)行判定時(shí)，在活力檢查的基礎(chǔ)上結(jié)合頂體染色是很必要的[8]。本研究選擇在常溫下保存120 h在活力檢測(cè)后進(jìn)行頂體染色檢查，結(jié)果顯示所有稀釋粉組精子活力都在64.9%以上，頂體完整率都在70%以上，說明6種稀釋液雖然保存精子活力的時(shí)間有差異，但保存5 d都不會(huì)影響正常的受精。

3.3 研制高效國產(chǎn)稀釋粉很有必要

目前養(yǎng)殖場使用較多的為進(jìn)口稀釋粉，雖然進(jìn)口稀釋粉價(jià)格較貴，但國產(chǎn)稀釋粉保存時(shí)間短、受精效果差，所以人們寧愿選擇較貴的稀釋粉來保證較好的保存與受精質(zhì)量，從而能在生產(chǎn)中得到較好的回報(bào)。因此，對(duì)好的進(jìn)口稀釋粉的成分進(jìn)行研究，在國內(nèi)已有稀釋劑中添加各種利于精子活力保存的成分，以期研制出價(jià)格低、保存時(shí)間長、受精能力強(qiáng)的稀釋粉，打破國人迷信進(jìn)口稀釋粉的狀況，推動(dòng)我國豬人工授精行業(yè)的快速發(fā)展。

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