劉鑫　關萍　彭昌琴　陳業(yè)　劉麗婷　陳興銀　石建明

摘要：采用PCR直接測序法，測定23種兜蘭屬植物的內部轉錄間隔區(qū)（ITS）序列，并結合GenBank中所查到的德氏兜蘭（AJ564372）、波瓣兜蘭（AY530916）及麻栗坡兜蘭（AJ564357）的核糖體DNA（nrDNA）ITS區(qū)序列進行比對，確定23種兜蘭的ITS1、5.8S及ITS2的界限。結果表明：23種兜蘭植物的nrDNA ITS序列長度為717～787 bp;G+C含量為48.6%～51.5%，其中ITS1和ITS2長度分別為393～451 bp及155～180 bp，包括211個變異位點;109個信息位點?；谪惾~斯法和最大簡約法構建系統(tǒng)聚類樹，結果表明，2種方法構建的樹基本一致，整個樹分為2個分支3個亞組，表明基于nrDNA ITS序列能夠鑒定分析兜蘭屬植物種間的親緣關系。

關鍵詞：兜蘭屬;nrDNA ITS;分子系統(tǒng)學

中圖分類號： Q949.71+8.43;S184文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）09-0100-04

兜蘭（Paphiopedilum Pfitz.）別稱女士拖鞋蘭，屬蘭科（Orchidaceae）中最原始的類群，與杓蘭屬（Cypripeium）、美洲兜蘭屬（Phragmipedium）被認為來自共同祖先[1-2]。全世界約有兜蘭屬植物80余種，主要分布于亞熱帶地區(qū)[3]。我國兜蘭屬植物資源豐富，主要分布于西南部和南部的熱帶與亞熱帶南緣地區(qū)，以云南、廣西和貴州等省份分布為主[4]。由于兜蘭具有極高的觀賞價值和經濟價值，人們對兜蘭野生資源進行了毀滅性的采挖，加之生境破壞等原因，導致野生兜蘭的數量急劇減少、分布區(qū)逐漸萎縮，已成為世界上最瀕危的植物物種之一，所有野生種類均被列入《瀕危野生動植物種國際貿易公約》（CITES）附錄Ⅰ而被禁止交易[5]。

長期以來，各種蘭花由于不同地域的相互引種栽培，出現了許多同物異名和同名異物的現象，品種名和品種分類十分混亂，用傳統(tǒng)手段進行雜種純度鑒定很費時，而且易受環(huán)境條件的影響，所以兜蘭屬植物的系統(tǒng)分類一直存在較大爭議[6-7]：基于形態(tài)學分類把兜蘭屬劃分為3個亞屬，即寬瓣亞屬（Brachypetalum）、小萼亞屬（Parvisepalum）和兜蘭亞屬（Paphiopedilum），其中兜蘭亞屬又分為多花型亞組（Coryopedilum）、長瓣兜蘭組（Pardalopetalum）、續(xù)花型亞組（Cochlopetalum）、兜蘭組（Paphiopedilum）和毛梗兜蘭組（Barbata）5個組;根據葉上表面是否有網格斑把中國兜蘭屬植物18個原生種劃分為2個亞屬：兜蘭亞屬（Paphiopedilum）和寬瓣亞屬（Brachypetalum）[8]。由此可見，兜蘭變異大，中間類型多，種間的界限不是很清楚，從形態(tài)學上很難將其區(qū)分開來，為了驗證兜蘭屬植物的系統(tǒng)發(fā)育關系，本研究基于nrDNA ITS序列分析技術，對我國兜蘭屬的不同種進行分子鑒定并進行系統(tǒng)發(fā)育分析，為兜蘭屬植物的分子系統(tǒng)學分析提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試兜蘭屬植物23個種的名稱及來源見表1，所有植物標本均儲藏于貴州大學植物標本館。

1.2 主要試劑

TaqDNA聚合酶（2.5 U/μL）、反應緩沖液（10×PCR buffer）、Mg2+（25 mmol/L）、脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）（2.5 mmol/L）、溴化十六烷三甲基銨（CTAB）、瓊脂糖、新型核酸染料（Goldview）、1×TAE電泳緩沖液、標準分子量（Marker）均購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 試驗地點與方法

1.3.1 試驗時間與地點 試驗于2018年3月在貴州大學生物技術實驗室進行。

1.3.2 基因組DNA的提取與PCR擴增

基因組DNA的提取參照CTAB法[9]并稍作改動，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測其濃度，TE緩沖液稀釋提取的DNA濃度至40 mg/L，放入-20 ℃冰箱保存。PCR擴增使用ITS通用引物F：（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），R：（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′），由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。ITS-PCR反應程序為：94 ℃預變性 4 min; 94 ℃變性30 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸 1 min，35個循環(huán);72 ℃延伸7 min后終止反應，4 ℃保存。擴增反應結束后，取擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳1 h左右，溴化乙錠（EB）染色后用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照保存。PCR產物送生工生物工程（上海）有限公司測序，所有擴增的序列已全部提交至GenBank（表1）。

1.3.3 序列分析及系統(tǒng)樹構建

用DNAstar[10]軟件對序列進行人工校正，確定ITS-1、ITS-2和5.8S rRNA區(qū)。用Clustalx 2.0.11軟件進行多重比構建矩陣并對G+C含量分析，采用貝葉斯法（BI）和最大簡約法（MP）建樹分析。MP樹使用MEGA 5.0[11]軟件分析，最大簡約分析采用啟發(fā)式搜索，序列矩陣中所有的堿基同等加權，并作為無序性狀，空位采用缺失處理，系統(tǒng)樹上各分支的相對支持率采用自舉檢驗法（bootstrap）進行1 000次重復取樣檢驗。貝葉斯分析采用MrBayes 3.2.1軟件[12]運算，用Jmodeltest 2.1.7軟件[13]檢測并選擇最優(yōu)堿基替代模型，設置批處理運行代數為1 000 000代，每1 000代保留1棵樹，用TreeGraph 2.0軟件[14]查看BI樹。

2 結果與分析

2.1 ITS區(qū)序列特征分析

將所測序列與GenBank中所查到的兜蘭屬瘤瓣兜蘭（AJ564365）、德氏兜蘭（AJ564372）、波瓣兜蘭（AY530916）及麻栗坡兜蘭（AJ564357）的ITS區(qū)序列進行比對，確定23種兜蘭的ITS-1、5.8S及ITS-2的序列界限。23種兜蘭屬植物的ITS區(qū)（包括5.8 s）序列長度為717～787 bp（表2和表3），其中白花兜蘭序列最長，為787 bp，紫紋兜蘭序列最短，為717 bp。23個種的ITS-1長度為393～451 bp，G+C量為45.6%～49.7%，排序后長度為465個位點，其中116個為變異位點，占24.9%，59個信息位點，占12.7%;23種的ITS-2的長度為155～180 bp，相差25 bp，長度差異為8.9%，G+C量為47.5%～53.4%，排序后長度為189位點，64個變異位點，占33.9%，32個信息位點，占16.9 %;5.8S序列長度為170 bp，G+C量為54.7%～57.7%。31個變異位點，占 18.2%，18個信息位點，占13.2%，全序列排序后的長度為824 bp，其中有211個變異位點，107個為系統(tǒng)發(fā)育的信息位點，分別占25.6%和13.0%，這極大方便了堿基序列多態(tài)信息的判讀，這對提高分子系統(tǒng)研究的準確性有重要作用。

2.2 遺傳距離分析

利用MEGA 6.0軟件的Kimura-2-parameter計算23種兜蘭屬植物的遺傳距離，結果（表4）表明，格力兜蘭和根莖兜蘭之間的遺傳距離值最小，為0.000，紫毛兜蘭與格力兜蘭和根莖兜蘭之間的遺傳距離值均為0.001，說明這3個種之間的親緣關系較近;而白花兜蘭與其他種之間的遺傳距離值均較大，說明與其他種的親緣關系相對較遠，其中與長瓣兜蘭和飄帶兜蘭之間的遺傳距離值最大，為0.104，說明白花兜蘭與長瓣兜蘭和飄帶兜蘭之間的親緣關系較遠。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

基于ITS序列構建最大簡約樹（MP tree）和貝葉斯樹（Bayes tree），2種方法構建的樹基本一致（圖1），分枝上面的數值分別代表后驗概率和自展支持值，其中左邊的數值代表BI樹的后驗概率值，右邊的數值代表MP樹的自展支持值。簡約樹樹長為250，一致性指數（CI）為0.775 1，維持性指數（RI）為0.870 5。由圖1可知，樹中形成2個大支3個亞屬，德氏兜蘭、杏黃兜蘭、麻栗坡兜蘭、硬葉兜蘭、白花兜蘭、漢氏兜蘭6個種聚為1支，支持率均大于99%，與傳統(tǒng)的基于形態(tài)性狀分類結果一致;文山兜蘭、巨瓣兜蘭、同色兜蘭聚為1個大支，支持率均大于97%，說明他們之間的親緣關系比較近;飄帶兜蘭和長瓣兜蘭聚為1支，再與天倫兜蘭、海倫兜蘭、小葉兜蘭、紫毛兜蘭等16個種聚為1支，后驗概率和支持率分別為80%和72%。

3 討論

核糖體DNA（nrDNA）內部轉錄間隔區(qū)（Internal transcribed spacer，ITS）序列是位于rDNA編碼基因18S、5.8S和28S之間的小基因片段，具有堿基變異位點多、保守性好等特點。因此被廣泛用于植物屬及種間的系統(tǒng)關系以及植物資源鑒定研究[15-16]。本研究結果表明，23種兜蘭的nrDNA ITS序列長度為717～787 bp，且出現了多種變異信息位點，如 T-C、T-G、A-G之間的轉換以及T-A、G-C之間的顛換，多數被檢測的兜蘭樣本nrDNA ITS序列具有豐富的堿基變異，并且大部分變異堿基可作為其識別特征，本研究中的23條兜蘭的nrDNA ITS序列中共有107個信息位點，占比 13.0%，這完全符合分子系統(tǒng)分析的標準，因為基因的變異在所研究的分類等級中應有5%～15%的系統(tǒng)發(fā)育信息位點變異，過高或過低的變異均影響分子系統(tǒng)分析[17]。

DNA是遺傳信息的載體，是基本的進化單位，能反映進化本質，核酸的基本序列是一元變化的，通常為點突變，趨同效應極小，以核酸為指標確定的關系不受主觀因素的影響，可以直接對遺傳變異和進化的分子基礎DNA等進行分析。DNA序列分析技術就是通過對DNA序列直接排序對比分析

[FK（W27][TPLX111.tif]

是研究遺傳多樣性、系統(tǒng)發(fā)育以及親緣關系分析的方法。目前應用于分子系統(tǒng)發(fā)育分析的核基因組序列主要是在編碼核糖體RNA重復區(qū)的一些序列，nrDNA ITS序列因具有科、屬、種水平上的特異性和較快的進化速率，能提供較豐富的變異位點和信息位點，被廣泛用于種屬間遺傳變異、親緣關系以及分子系統(tǒng)學研究[18-19]。ITS序列在基因組中高度重復，通過基因轉換及不等交換，這些重復單位已發(fā)生了位點間或者位點內的同步進化，為PCR產物的直接測序奠定了理論基礎[20-21]。本研究基于ITS聚類分析結果，將23種中國兜蘭屬植物劃分為Parvisepalum、Brachypetalum和Paphiopedilum 3個亞屬，Paphiopedilum再劃分為長瓣兜蘭組（Pardalopetalum）和兜蘭組（Paphiopedilum）2個組，這一點與Cribb的分類[7]一致，但是Cribb把紫紋兜蘭（P. purpuratum）和彩云兜蘭（P. wardii）劃分到毛梗兜蘭組（Barbata），而且認為毛梗兜蘭組屬于兜蘭亞屬，而本研究中紫紋兜蘭和彩云兜蘭聚為最外面，這與孫彩云等利用RAPD和同工酶研究中國兜蘭屬種間親緣關系[22]一致，但不支持兜蘭亞屬進一步分組的說法，建議彩云兜蘭和紫紋兜蘭可以自成1個組，但就其分類學位置的確定還需要結合其他分子標記技術或形態(tài)學性狀等進一步研究。

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