向麗媛 徐 凱 蘇 靜 吳 超 袁 雄 鄭興飛 刁 英 胡中立 李蘭芝,*

1 湖南農業(yè)大學 / 湖南省農業(yè)大數(shù)據(jù)分析與決策工程技術研究中心,湖南長沙410128；2 武漢大學 / 雜交水稻國家重點實驗室,湖北武漢430072

水稻農藝性狀包括株高、穗長、有效穗數(shù)、穗粒數(shù)、穗實粒數(shù)和千粒重等,通過研究和改良農藝性狀可以提高產量,培育高產品種。隨著高通量測序技術的發(fā)展,水稻全基因組測序的完成成為水稻品種改良重要轉折點。全基因組關聯(lián)分析(genome- wide association study,GWAS)是一種對全基因組范圍內常見遺傳變異(單核苷酸多態(tài)性和拷貝數(shù))總體關聯(lián)分析的方法。自植物中第一篇使用高分辨GWAS 鑒定數(shù)量性狀相關基因/QTL 的報道[1]以來,在水稻中進行全基因組關聯(lián)分析的報道越來越多,Yonemaru 等[2]對抽穗期、粒長、千粒重、籽粒表面積、每穗粒數(shù)、抗病6 個產量相關的性狀進行全基因組關聯(lián)分析,鑒定到8 個顯著相關位點。Huang等[3]對517 份實驗材料進行高通量測序,對株高等14 個農藝性狀進行GWAS 分析,鑒定出了37 個顯著關聯(lián)的變異位點,且每個位點能夠解釋大約36%的表型變異,給水稻的遺傳育種研究提供了重要的理論基礎。GWAS 的出現(xiàn)加快了學者對各種性狀遺傳機制的認識,但該方法也存在以下局限性[4]：(1)目前,GWAS 利用SNP 芯片技術檢測的SNP 大多是根據(jù)高密度單倍型圖譜數(shù)據(jù)得來的,或者是以一定物理位置間隔選擇的SNP。因此,關聯(lián)分析所獲得的SNP 位點不一定真正與性狀有關,或位置有所偏差。(2)為防止假陽性關聯(lián),GWAS 分析采用非常嚴格的P值,因而很可能漏掉一些P值未達到GWAS要求的閾值但實際上有關聯(lián)的SNP。(3)GWAS 分析通常局限于單個位點的邊際效應[5],但很多性狀的調控機制是由多個基因相互作用引起的。

針對GWAS 存在的缺點,也出現(xiàn)了很多相應的方法。如基于Wang 等[6]提出的多位點隨機SNP 效應混合模型方法,編寫了mrMLM 軟件包(https：// cran.rproject.org/web/packages/mrMLM/index.html)。Hirschhorn[7]提出了基于通路的研究方法,利用基因功能、代謝通路等相關信息對GWAS 結果進行深入挖掘。當前以SNP 為對象的GWAS 通路分析算法分為非核算法和核算法兩大類[8],其中非核算法主要包括基因功能富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)和分層貝葉斯優(yōu)取(hierarchical Bayes prioritization,HBP),核算法包括線性核(linear kernel,LIN)、狀態(tài)認證核(identity-by-status kernel,IBS)和尺度不變核(powered exponential kernel,PEK)。GSEA是目前GWAS 通路分析最常用的方法之一,GSEA 的結論基于一組相關基因而非單個基因,因此富集分析增加了研究的可靠性,且能識別出與生物現(xiàn)象最相關的生物過程,相比于單基因方法更有利于得到有意義的通路；同時比基于經典完備統(tǒng)計學理論的結果更穩(wěn)定可靠。

目前,通路分析法在水稻中的研究較少,張遠森[9]用GSEA 方法檢測出103 個通路與14 個水稻農藝性狀相關聯(lián),其中質體通路與抽穗天數(shù)、小穗數(shù)和分蘗數(shù)等13 個水稻農藝性狀相關。此外,水稻一般配合力的高低與雜種優(yōu)勢對于是否能獲得優(yōu)良水稻品種同樣重要。North Carolina design II(NCII)設計被廣泛認為是進行配合力和雜種優(yōu)勢研究的經典遺傳設計[10]。Liu 等[11]利用廣陸矮4 號和特青產生的F2回交群體與不育系,按NCII 設計進行測交。發(fā)現(xiàn)一般配合力較低的親本,子代的株高、抽穗期、穎花數(shù)這3 個性狀反而呈現(xiàn)超表達,且其一般配合力效應顯著上升。我們前期研究[10]用三系野敗型雜交水稻的恢復系和微核心種質構成的品種群體,按照NCII 遺傳交配設計,分別與5 個不育系測交,分析親本一般配合力與相對競爭優(yōu)勢的相關性,表明親本一般配合力之和與相對競爭優(yōu)勢在千粒重、株高、主穗二次枝梗數(shù)、主穗實粒數(shù)、主穗一次枝梗數(shù)、主穗穎花數(shù)性狀間均呈極顯著正相關。付新民等[12]利用野敗型雄性不育系和恢復系,按照NCII 遺傳交配設計表明,在水稻培育中,應當根據(jù)不同性狀考慮不育系和恢復系對農藝性狀的影響,進一步提高雜交水稻的雜種優(yōu)勢水平。梁康逕[13]采用包括現(xiàn)今生產上大面積推廣的秈型恢復系在內組成的秈粳雜交水稻遺傳群體,按NCII 設計,主要分析其穗部性狀的雜種優(yōu)勢的遺傳規(guī)律,建議適當擴大雙親的遺傳差異,以保持雜種優(yōu)勢水平,并與培育目標和組合測配特點相結合,有效地培育適合不同環(huán)境或特定環(huán)境的超高產組合。

盡管關于水稻農藝性狀全基因組關聯(lián)分析、基于NCII 遺傳設計的水稻配合力和雜種優(yōu)勢的研究很多,但是關于水稻農藝性狀配合力和雜種優(yōu)勢的全基因組通路分析還未見報道。農藝性狀的配合力和雜種優(yōu)勢,均類似于農藝性狀表型本身,為數(shù)量性狀,受多個基因控制。本研究按照NCII 遺傳交配設計,構建測交群體,考察包括產量性狀在內的 9個農藝性狀,對水稻農藝性狀表型、配合力和雜種優(yōu)勢進行通路分析,以期為水稻品種的培育和改良提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 研究材料

部分材料由華中農業(yè)大學余四斌教授、四川農業(yè)大學李雙成教授和揚州大學湯述翥教授饋贈。其中含29 份三系野敗型雜交水稻的恢復系和86 份微核心種質構成品種群體。4 個兩系不育系[矮64S(PA64)、廣占 63S(GZ63)、Y58S 和新安S(AS)]及1個三系不育系[珞紅3A(3A)]構成測交不育系。以上材料均為秈稻(詳見附表1)。根據(jù)這5 個不育系(母本)和115 個秈稻品種(父本)的SNP 信息,進而推算出測交群體F1代的SNP 基因型用于后續(xù)分析。

根據(jù)NCII 遺傳交配設計,在海南陵水開展雜交試驗,構建測交群體。分別在2011年、2012年湖北鄂州、海南陵水兩地進行雜交,獲得F1雜交種。115個父本與575 個F1雜交子代于2013年種植在華中農業(yè)水稻基地,田間種植1 行10 株,種植密度16.7 cm × 26.7 cm,每點2 次重復,隨機區(qū)組設計種植。

水稻成熟后于田間考察株高,收種時,從中間8株中選擇長勢均一的3 株收種,室內考察單株主穗實粒數(shù)(filled grains per panicle,FGPP)、千粒重(1000-grain weight,KGW,g)、主穗長(main panicle length,MPL,cm)、主穗一次枝梗數(shù)(primary branch of main panicle,PBP)、株高(plant height,PH,cm)、主穗二次枝梗數(shù)(secondary branch of main panicle,SBP)、主穗穎花數(shù)(spikelet per panicle,SPP)、有效穗數(shù)(effective tillers per plant,TP)、單株實粒重(yield,YD,g)9 個農藝性狀。

1.2 數(shù)據(jù)處理

為了深入了解水稻農藝性狀的遺傳機制,把每個性狀對應的數(shù)據(jù)集分成V、GCA、TC 和BP4 類。V 代表親本(父本)的表型,GCA 代表親本(父本)的一般配合力,TC 代表測交群體的表型,BP 代表測交群體的超親優(yōu)勢值,BP=F1-Pat,Pat 表示父本的表型值。對這4 類數(shù)據(jù)分別進行GWAS 分析。

1.3 全基因組關聯(lián)分析

將收集到的水稻9 個農藝性狀數(shù)據(jù)經過質量控制,經刪除maf＜5%、缺失基因個數(shù)＞20%的SNP 等一系列數(shù)據(jù)處理,得到1,894,012 個SNP。以GAPIT 軟件[14]的CMLM 模型進行關聯(lián)分析處理。以P-value ＜ 10-4為標準篩選顯著性的SNP[15],用于后續(xù)的分析。

1.4 水稻基因注釋信息獲取

在國家水稻數(shù)據(jù)中心(http：//www.ricedata.cn/,截至2018年10月15日)查找相關基因的注釋信息,利用python(version 3.5.4)腳本實現(xiàn)多個檢索爬取結果于本地。

1.5 通路分析

通過PlantGSEA(http：//structuralbiology.cau.edu.cn/PlantGSEA/index.php),將爬取的結果用于分析。用PlantGSEA 篩選出具有顯著性功能的通路[9]。

2 結果與分析

2.1 PlantGSEA 結果分析

針對9 個農藝性狀,在V、GCA、TC、BP 四個數(shù)據(jù)集中分別共檢測到100、107、118、33 個通路,其中有5 個通路是4 個數(shù)據(jù)集共有的(圖1),包括催化活性(GO：0003824)、陽離子結合(GO：0043169)、離子結合(GO：0043167)、代謝過程(GO：0008152)、初級代謝過程(GO：0044238)(表1)。對于這些通路,本研究將從9 個農藝性狀分別進行詳盡的闡述。

圖1 4 個數(shù)據(jù)集所含通路 Fig.1 Pathways in the four datasets

表1 4 個數(shù)據(jù)集共有的通路 Table1 Common pathways in four datasets

2.1.1 主穗實粒數(shù) 在V、GCA、TC 數(shù)據(jù)集中與水稻主穗實粒數(shù)相關聯(lián)的通路數(shù)分別為1、37 和4 個(圖2,詳見附表2,附表3,附表4)。其中包括生物調控(GO：0065007)、調節(jié)基因表達(GO：0010468)相關通路。在TC 數(shù)據(jù)集中有flo-2基因。She 等[16]研究表明flo-2通過影響胚乳中儲藏性物質的積累,在調控水稻籽粒大小和淀粉品質中發(fā)揮關鍵作用。結果表明基因表達、生物調控過程都對主穗實粒數(shù)產生影響。

2.1.2 千粒重 在V、GCA、TC 數(shù)據(jù)集中與水稻千粒重相關聯(lián)的通路數(shù)分別為7、1 和4 個(圖2,詳見附表2,附表3,附表4)。其中包含半胱氨酸和蛋氨酸代謝(KEGG)相關通路。GCA、TC 數(shù)據(jù)集中都含有GS3基因。Mao 等[17]研究表明GS3是一個控制籽粒大小的主效QTL,它在調節(jié)籽粒和器官大小中具負調節(jié)子的功能。野生型等位基因包含N 端的OSR 結構域,一個跨膜區(qū),TNFR/NGFR 家族富半胱氨酸結構域,以及C 端的VWFC 4 個推測的結構域。C 端TNFR/NGFR 和VWFC 結構域顯示出對OSR功能的抑制作用,這2 個功能域失活突變會產生非常短的籽粒。V、TC 數(shù)據(jù)集中含有甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝(KEGG)通路和SaM基因。Long 等[18]研究表明Sa基因座,影響水稻秈粳亞種間雜交F1代的育性,秈粳等位基因之間的互作導致雄配子敗育,結實率下降。Sa位點實際上是由SaM和SaF兩個相鄰的基因位點組成。SaF編碼一個476 氨基酸組成的F-box 蛋白,與SaF+相比,SaF -發(fā)生一個單核苷酸突變,導致編碼產物第287 氨基酸由苯丙氨酸置換為絲氨酸。以上結果表明半胱氨酸以及絲氨酸代謝通路都會影響到粒重。

圖2 4 個數(shù)據(jù)集9 個性狀通路結果 Fig.2 Pathways of nine traits in the four datasets

2.1.3 主穗長 在V、GCA、TC 數(shù)據(jù)集中與水稻主穗長相關聯(lián)的通路數(shù)分別為2、1 和3 個(圖2,詳見附表2,附表3,附表4)。包括SNARE 相關囊泡運動(KEGG)等通路。真核生物細胞囊泡運輸過程中的膜融合主要是由SNARE 蛋白介導的,SNARE 蛋白的結構高度保守。鮑永美[19]研究發(fā)現(xiàn),植物中的SNARE 蛋白促進植物細胞板形成,能與離子通道蛋白相互作用,有利于植物的正常生長發(fā)育,能提高植物的抗病性及參與植物的向重力性作用。

2.1.4 主穗一次枝梗 在V、GCA、TC、BP 數(shù)據(jù)集中與水稻主穗一次枝梗相關聯(lián)的通路數(shù)分別為76、25、26 和19 個(圖2,詳見附表2,附表3,附表4,附表5)。其中包括序列特異性DNA 結合轉錄因子 活 性(GO：0003700)、依賴DNA的轉錄(GO：0006350)相關通路。其中 V 數(shù)據(jù)集中含有OsAP2-39基因。Yaish 等[20]研究表明OsAP2-39是水稻中的類APETALA-2 轉錄因子,含有一個AP2 結構域,控制脫落酸與赤霉素間的關鍵互作,植物激素間的互作是調控植物生長發(fā)育的一個重要機制。

2.1.5 株高 在V、GCA、TC 數(shù)據(jù)集中與水稻株高相關聯(lián)的通路數(shù)分別為3、41 和50 個(圖2,詳見附表2,附表3,附表4)。其中包括 ATP 結合(GO：0005524)、大分子代謝過程(GO：0043170)相關通路。在GCA、TC 中含有nd1基因。Li 等[21]研究表明nd1株高變矮,莖和根尖初生細胞壁的結構均有缺陷,莖中,木糖和纖維素含量降低,同聚半乳糖醛酸含量增加。以上結果表明ATP 結合、大分子代謝過程將會影響株高性狀的形成。

2.1.6 主穗二次枝梗 在GCA、TC 數(shù)據(jù)集中與水稻主穗二次枝梗相關聯(lián)的通路數(shù)分別為55 個和54 個(圖2,詳見附表3,附表4)。也包括一次枝梗中的分子功能,如依賴DNA 的轉錄(GO：0006350)。

2.1.7 主穗穎花數(shù) 在V、GCA、TC、BP 數(shù)據(jù)集中與水稻主穗穎花數(shù)相關聯(lián)的通路數(shù)分別為21、54、76 和4 個(圖2,詳見附表2,附表3,附表4,附表5)。其中包括花粉識別(GO：0048544)、花粉-雌蕊互作(GO：0009875)相關通路。

2.1.8 有效穗數(shù) 在V、TC、BP 數(shù)據(jù)集中與水稻有效穗數(shù)相關聯(lián)的通路數(shù)分別為5、3 和10 個(圖2,詳見附表2,附表4,附表5)。其中包括水解酶活性(GO：0016798 )等通路。

2.1.9 單株實粒重 在GCA、TC 數(shù)據(jù)集中與水稻單株實粒重相關聯(lián)的通路數(shù)分別為34 個和49 個(圖2,詳見附表3,附表4)。其中包括嘌呤核苷結合(GO：0001883)相關通路,表明嘌呤核苷結合將影響到單株實粒重。

2.2 多性狀間相同的通路分析

水稻農藝性狀通常由多個基因或者多個通路共同控制調節(jié),由表2可知,V中參與多個性狀(1～3個)的通路個數(shù)分別是86、13 和1 個(詳見附表6)。GCA中參與多個性狀(1～6 個)的通路個數(shù)分別是52、11、11、25、22、7 和1 個(詳見附表7)。TC 中參與多個性狀(1～5 個、7 和8 個)的通路個數(shù)分別是51、20、32、4、7、1 和3 個(詳見附表8)。BP 中參與1 個性狀的通路個數(shù)是33 個(詳見附表9)。

表2 4 個數(shù)據(jù)集不同性狀個數(shù)所含的通路個數(shù) Table2 Number of paths contained in four datasets with different traits

在4 個數(shù)據(jù)集中催化活性(GO：0003824)、陽離子結合(GO：0043169)、離子結合(GO：0043167)、代謝過程(GO：0008152)等通路在9 個農藝性狀中都有,表明某一通路可能影響多個性狀。

在GCA 數(shù)據(jù)集中的PBP 和SBP 性狀中都存在依賴DNA 的轉錄(GO：0006350)、另一種依賴于DNA 的轉錄調節(jié)(GO：0045449)。在TC 數(shù)據(jù)集中PBP、SBP 與MPL 都含有細胞組分(GO：0005575),生物過程(GO：0008150)通路。表明一次枝梗和二次枝梗的生長存在著聯(lián)系,且一次枝梗和二次枝梗的數(shù)目和長度對水稻穗長的形成也有著一定的影響。

在TC 數(shù)據(jù)集中性狀KGW 和YD 有細胞組分(GO：0005575)、生物過程(GO：0008150)通路。表明水稻的粒重與產量之間存在著聯(lián)系,且粒重又是產量構成的重要因素之一。

同時在TC 數(shù)據(jù)集中性狀YD 也含有PH 中的大分子代謝過程(GO：0043170)、細胞大分子代謝過程(GO：0044260)、大分子修飾(GO：0043412)通路,表明株高與水稻產量也有著一定的聯(lián)系。

水稻的農藝性狀大多是數(shù)量性狀,由上述結果可以看到水稻的各個性狀的遺傳機制并不是完全獨立,而是相互之間有著一定的聯(lián)系。千粒重、株高、主穗一次枝梗、主穗二次枝梗都與產量相關,且主穗一次枝梗與二次枝梗與穗長相關。石晗[22]研究表明單株理論產量與穗長、株高、有效穗數(shù)、單穗實粒重、每穗粒數(shù)等呈顯著或極顯著正相關,有效穗數(shù)與單株理論產量成極顯著正相關,每穗粒數(shù)與株高、穗長都呈極顯著正相關。我們的結果與其部分相符,這表明我們的結果具有一定的可靠性。

3 討論

對于農藝性狀的研究,黃利興等[23]認為單株有效穗、穗長、穗總粒數(shù)、穗粒數(shù)、結實率、千粒重和著粒密度7 個農藝性狀親本的表現(xiàn)與一般配合力的效應值呈顯著性正相關。廖伏明等[24]認為一般配合力與親本自身的表型值有一定程度的正相關,說明在育種過程中必須注意親本自身農藝性狀的改良。付新民等[12]的研究表明生育期、株高、單株有效穗數(shù)、每穗總粒數(shù)、結實率和千粒重性狀一般配合力與其表型值間的相關達到顯著或極顯著水平。說明這些性狀可以通過其表型選擇提高一般配合力。同樣,我們的前期研究[8]表明除親本單株實粒重與一般配合力間相關性不顯著外,親本農藝性狀與其一般配合力均為正相關。

在本研究GCA 與V 中相同的通路有65 個,除了生物生長所需的基本代謝通路 DNA 結合(GO：0003677)、蛋白質代謝過程(GO：0019538)、離子結合(GO：0043167)等外,其中也包括一些影響相關性狀的通路,如半胱氨酸和蛋氨酸代謝(KEGG)、激酶活性(GO：0016301)、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝(KEGG)等。張遠森[9]研究表明水稻粒重與細胞蛋白變性過程(GO：0006464)、激酶活性(GO：0016301)等通路相關。我們的結果與其部分相符。

共同的通路在親本性狀和一般配合力中都起著一定的作用,表明性狀和一般配合力之間有著一定的相關性,這與前面學者研究得到的結果相符。已知與性狀相關的代謝通路,那么該通路中的相關的節(jié)點基因可能對該性狀具有調控作用。而對于一般配合力的改良,我們可以通過找到影響相關性狀代謝通路的節(jié)點基因,改良相關性狀,以期改良一般配合力。

在本研究的TC 與BP 中相同的通路有6 個,包括催化活性(GO：0003824)、陽離子結合(GO：0043169)、離子結合(GO：0043167)、代謝過程(GO：0008152)、初級代謝過程(GO：0044238)、水解酶活性(GO：0016787)等。

既然雜種數(shù)量性狀表型與雜種優(yōu)勢存在共同的通路,表明二者存在著一定的聯(lián)系。而雜種優(yōu)勢的出現(xiàn),可能是由于基因組合引起的。所以對于雜種優(yōu)勢的研究,我們可以從某一性狀的相關通路進行,找到調控該通路的相關基因,以期改良該性狀,更好地挖掘雜種優(yōu)勢。這為揭示雜種優(yōu)勢的遺傳機理提供了一定的理論基礎。

對于大部分數(shù)量性狀,用于定位的表型數(shù)據(jù)直接來源于大田或溫室的測量值,或是對多年多點的數(shù)據(jù)測量值的線性估計,稱為構成形狀。將表型值需要通過其他數(shù)量形狀測量值的代數(shù)運算而獲得的性狀成為復合形狀[25]。一般配合力和超親優(yōu)勢值都屬于復合形狀。

水稻的長寬比(粒型)是一個重要的復合性狀,Li等[26]對一個大小為308 的水稻BC3F1群體的粒長、粒寬和粒型進行了QTL 分析。在第3 和第10 染色體上發(fā)現(xiàn)2 個控制粒長,第12 條染色體上1 個控制粒寬的QTL。2 個控制粒型的QTL,其位置與控制粒長的2 個QTL 相近。而Rabiei 等[27]對一個大小為192 的水稻F2群體的粒長、粒寬和粒型進行了QTL分析。在這18 個QTL 中,5 個控制粒長,7 個控制粒寬,6 個控制粒型,其中有1 個解釋15.0%表型變異的粒型QTL,既沒有被粒長發(fā)現(xiàn),也沒有被粒寬發(fā)現(xiàn)。

從Li 等[26]和Rabiei 等[27]對于水稻粒型的遺傳研究來看,復合性狀的QTL 作圖和構成性狀的QTL作圖會得到不同的結果,有時甚至出現(xiàn)一些復合性狀僅有的QTL。在本研究中,表型性狀與一般配合力及超親優(yōu)勢值存在不同的通路,其之間的遺傳基礎應該存在著差異。其遺傳機理是一個復雜的過程,到目前并沒有詳盡標準的參考,而本研究也為遺傳機理的解釋提供理論基礎,使水稻雜種優(yōu)勢以及一般配合力的遺傳機理得到更全面的揭示。

本研究表明對于改良一般配合力和雜種優(yōu)勢,可以從水稻各性狀的代謝通路出發(fā),找到該通路中的控制該性狀的相關基因,改良相關性狀、一般配合力和雜種優(yōu)勢。一個生物學過程是一個復雜的網絡調控過程,由基因組調控,并非單基因,本研究從基因集的水平出發(fā),利用通路分析法對于雜種優(yōu)勢的獲得以及一般配合力的改良提出了新的思路。

4 結論

基于通路分析的方法剖析水稻農藝性狀配合力和雜種優(yōu)勢,4 個數(shù)據(jù)集分別得到了100、107、118、33 個與農藝性狀相關的通路。對于改良一般配合力和雜種優(yōu)勢,可從基因集水平出發(fā),找到通路中的控制該性狀的相關基因,以改良相關性狀、一般配合力和雜種優(yōu)勢。本研究結果可為后續(xù)解析水稻農藝性狀一般配合力和雜種優(yōu)勢的遺傳機理提供重要的理論基礎。

附表請見網絡版：1)本刊網站http：//zwxb.chinacrops.org/；2)中國知網http：//www.cnki.net/；3)萬方數(shù)據(jù) http：//c.wanfangdata.com.cn/Periodical-zuowxb.aspx。