谷海燕，律苗，丁玲，馬萌，張楠，李拓，李娜

疫苗用原輔料中豬源性病毒PCR檢測方法的建立

谷海燕，律苗，丁玲，馬萌，張楠，李拓，李娜

100176 北京生物制品研究所有限責(zé)任公司質(zhì)量檢定室（谷海燕、律苗、丁玲、馬萌、李拓、李娜），疫苗 5 室（張楠）

豬源性病毒是一類廣泛寄生于豬體內(nèi)的病毒，其不只感染豬，對人和多種哺乳動物也能造成感染，并可能致病[1-2]。2015 版《中國藥典》要求[3]，制備疫苗用的動物細胞需要檢測豬源性病毒為陰性。目前生物制品中越來越多涉及到豬來源的原料或輔料，如疫苗生產(chǎn)中使用的胰蛋白酶和水解乳蛋白及明膠等。雖然目前法規(guī)并未將豬源性病毒納入原輔料質(zhì)控，但是一些豬來源原輔料有攜帶豬源性病毒的風(fēng)險，其中包括豬圓環(huán)病毒 1（porcine circovirus 1，PCV1）、豬圓環(huán)病毒 2（porcine circovirus 2，PCV2）及豬細小病毒（porcine parvovirus，PPV）。確保生產(chǎn)用原輔料不攜帶豬源性病毒是生產(chǎn)出合格疫苗產(chǎn)品的保證，因此質(zhì)控原輔料中豬源性病毒至關(guān)重要。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、細菌、質(zhì)粒、胰蛋白酶及水解乳蛋白 大腸桿菌（批號：2017053104-3）、金黃色葡萄球菌（批號：2017053104-3）、麻疹病毒標(biāo)準(zhǔn)品（批號：20150902213）、風(fēng)疹病毒標(biāo)準(zhǔn)品（批號：2015S0401）及所有標(biāo)準(zhǔn)菌毒株均購自中國食品藥品檢定研究院；水解乳蛋白（批號：1833902）和胰蛋白酶（批號：C01171008）均購自美國 Gibco 公司。PCV1、PCV2、PPV 陽性質(zhì)粒由生工生物工程（上海）股份有限公司合成構(gòu)建。

1.1.2 主要試劑及儀器 胰蛋白酶和酵母提取物購自美國 Oxid 公司；Taq DNA 聚合酶購自日本 Takara 公司；DNA marker、Gel-red、病毒 DNA/RNA 提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒均購自天根生化科技有限公司；瓊脂糖和氯化鈉購自國藥化學(xué)試劑有限公司；PCR 儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)為美國 Bio-Rad 公司設(shè)備。

1.2 方法

1.2.1 基因組合成 根據(jù) GenBank 中的登錄號，PCV1（GenBank：AY193712.1）合成其 929 ~ 1655 bp 位點核酸序列，PCV2（GenBank：AY181946.1）合成其 1151 ~1584 bp 位點核酸序列，PPV（NC：001718）合成其 3001 ~ 3531 bp 位點核酸序列，合成的序列構(gòu)入 pUC57 載體，并轉(zhuǎn)化 top10 感受態(tài)細胞，由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2.2 陽性模板 分別取 10 μl 3 種菌液，涂布于 Amp 抗性的 LB 平板，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取單克隆菌落，接種于 LB 液體培養(yǎng)基，220 r/min、37 ℃培養(yǎng) 16 h 后收集菌體，利用質(zhì)粒小提試劑盒對菌體中質(zhì)粒進行提取，檢測濃度和純度后作為實驗用陽性對照模板。

1.2.3 引物設(shè)計及合成 利用文獻[4]報道的豬源性病毒檢測引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，合成后的引物稀釋成 10 μmol/L 備用，設(shè)計引物如表 1所示。

表 1 引物信息

1.2.4 PCR 反應(yīng)條件優(yōu)化 PCR 反應(yīng)體系為：陽性模板 2.5 μl，上游引物（10 μmol/L）1.25 μl，下游引物（10 μmol/L）1.25 μl，Ex Taq 0.25 μl，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μl，10 × Buffer 2.5 μl，滅菌水補至 25 μl。將體系放入 PCR 儀，反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性 4 min，95 ℃變性 30 s，（50 ~ 64 ℃）退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，72 ℃延伸最后一次 10 min，4 ℃保溫。在 PCR 退火溫度設(shè)置中，設(shè)置了 50 ~ 64 ℃8 個退火溫度，PCR 完成后取 5 μl 樣品進行凝膠電泳分析，確定其最佳退火條件。

1.2.5 方法驗證[5-8]

1.2.5.1 中間精密度 由兩名實驗人員分別進行，時間間隔 24 h，連續(xù) 5 d 檢測同一陽性樣品 5 次，評價此方法檢測原輔料中豬源性病毒的中間精密度。

1.2.5.2 專屬性驗證 分別取陽性樣品、大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)品、金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)品、麻疹病毒標(biāo)準(zhǔn)品、風(fēng)疹病毒標(biāo)準(zhǔn)品及無菌水，編號為 1 ~ 6，對 6 個樣品分別利用 3 對引物進行 PCR 檢測，驗證實驗室常見的微生物，驗證此方法對 PCV、PPV 檢測的專屬性。

1.2.5.3 檢測限驗證 將提取的質(zhì)粒濃度調(diào)整為 1 ng/μl，再用無菌水將質(zhì)粒進行 10 倍梯度稀釋，對稀釋后的質(zhì)粒進行 PCR 檢測，驗證此方法對豬源性病毒的最低檢測限度。

1.2.5.4 重復(fù)性驗證 同時取陽性樣品 6 份，在相同的測量環(huán)境下，對 6 份樣品進行 PCR檢測。驗證此方法對原輔料中豬源性病毒檢測的重復(fù)性。

1.2.5.5 耐用性驗證 取 2 份陽性樣品，在相同的環(huán)境下配制反應(yīng)體系，然后將反應(yīng)體系分別在室溫放置 15、30 min后進行 PCR 檢測。驗證在日常工作中室溫對體系耐用性造成的影響。

1.2.6 樣品檢測 取一批供試品胰蛋白酶及兩批水解乳蛋白，溶解后利用病毒基因組提取試劑盒，按照說明書提取病毒基因組 DNA，再進行 PCR、電泳后凝膠成像，進行 PCV1、PCV2 及 PPV 檢測。

2 結(jié)果

2.1 PCR 反應(yīng)條件優(yōu)化

實驗結(jié)果表明，在引物濃度為 10 μmol/L 時候，PCR 擴增效果很好。在 PCV1 和 PPV 實驗組中設(shè)置了 50 ~57 ℃的退火溫度范圍，實驗表明，在 54 ℃退火 30 s 時，PCR 擴增效果最佳，擴增條帶明亮清晰，條帶特異。在 PCV2 實驗組中首先設(shè)置了 50 ~ 57 ℃退火溫度范圍，結(jié)果無特異條帶產(chǎn)生，將退火溫度提高至 64 ℃時，產(chǎn)生特異條帶，PCR 擴增結(jié)果見圖 1。

2.2 中間精密度

經(jīng)過 2 名實驗員每次間隔 24 h，連續(xù) 5 d 對 3 種陽性對照連續(xù)進行 PCR 檢測，均在目標(biāo)區(qū)域產(chǎn)生特異性條帶，中間精密度驗證結(jié)果良好，結(jié)果如表 2 所示。

2.3 專屬性驗證

為了驗證該方法是否容易被實驗室常見的微生物污染，選用大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、風(fēng)疹病毒、麻疹病毒作為 PCR 模板，利用優(yōu)化的反應(yīng)條件，進行 PCR 檢測。結(jié)果表明，選擇的引物對實驗室常見的核酸模板不具有特異性，其專屬性良好（圖 2）。

2.4 檢測限驗證

對稀釋后的陽性樣品進行 PCR 檢測，驗證此方法對豬源性病毒的最低檢測限度。結(jié)果如圖 3 所示，在陽性質(zhì)粒稀釋度為 100 fg/μl 時仍可檢測出。

2.5 重復(fù)性驗證

為了驗證 PCR 檢測原輔料中豬源性病毒的重復(fù)性，在同一條件下，取同一陽性樣品分為 6 份，對 6 份樣品在相同的條件下進行 PCR 檢測。結(jié)果表明，6 次檢測均能在特異大小區(qū)域得到特異的條帶，該方法重復(fù)性較好，試驗結(jié)果如表 3 所示。

2.6 耐用性驗證

為了驗證 PCR 體系的耐用性，將配置好的 PCR 反應(yīng)體系分別在室溫放置 15 和 30 min，然后進行 PCR 檢測。結(jié)果表明，在放置 30 min 后，該反應(yīng)體系依然能很好檢測出特異的目標(biāo)條帶，結(jié)果如圖 4 所示。

bp M 1 2 3 4 4500300020001200800500 200

表 2 方法驗證的中間精密度結(jié)果

bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 4500300020001200800500200

2.7 樣品檢測結(jié)果

取一批供試品胰酶及兩批水解乳蛋白，樣品溶解后使用試劑盒提取病毒基因組 DNA，再運用 PCR 對其進行 PCV1、PCV2 及 PPV 檢測，電泳后凝膠成像結(jié)果如圖 5 所示，兩批樣品中 PCV1、PCV2 及 PPV 都呈陰性。

bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 4500300020001200800500 200

表 3 重復(fù)性驗證結(jié)果

bp M 1 2 3 4 5 6 7 4500300020001200800500200

bp M 1 2 3 4 5 M 6 7 8 9 10 M 11 12 13 14 15 20001000750500200100

M：DNA marker；1：PCV1 陽性；2：水解乳蛋白 1 PCV1 檢測；3：水解乳蛋白 2 PCV1 檢測；4：胰酶 PCV1 檢測；5：PCV1 陰性對照；6：PCV2 陽性；7：水解乳蛋白 1 PCV2 檢測；8：水解乳蛋白 2 PCV2 檢測；9：胰酶 PCV2 檢測；10：PCV2 陰性對照；11：PPV 陽性；12：水解乳蛋白 1 PPV 檢測；13：水解乳蛋白 2 PPV 檢測；14：胰酶 PPV 檢測；15：PPV 陰性對照

圖 5 PCR 檢測 3 批樣品 PCV1、PCV2、PPV 結(jié)果

3 討論

隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展以及對生物制品認識越來越全面，人們對生物制品質(zhì)量控制的要求越來越高，要求我們對生物制品中的有效成分及雜質(zhì)含量能夠充分了解，并評估雜質(zhì)存在可能造成的影響。2010 年科學(xué)家 Victoria 等[9]利用基因組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)某疫苗中含有 PCV1 病毒基因組序列，隨后其他生物制品中發(fā)現(xiàn)豬源性病毒污染。人用生物制品中外源病毒成為了各國藥監(jiān)部門關(guān)注的焦點，也使得生物制品在外源因子質(zhì)量控制方面向前邁進一步。本文利用合成病毒基因作為陽性對照模板[4]，驗證 PCR 法檢測疫苗用原輔料中豬源性病毒，分別從中間精密度、專屬性、檢測限、重復(fù)性和耐用性 5 個方面來驗證該方法檢測 PCV1、PCV2 及 PPV的可行性。結(jié)果達到預(yù)期，PCR 法可用于疫苗用原輔料中豬源性病毒檢測。

豬源性病毒實驗室檢測方法眾多，傳統(tǒng)檢測有酶聯(lián)免疫吸附試驗、巢式 PCR 法、實時定量 PCR 法、環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增法、基因芯片等一系列方法[10]。其中熒光定量 PCR 檢測豬源性病毒靈敏度更高，但是熒光定量 PCR 法存在一些缺點，如成本高、技術(shù)要求高、極易出現(xiàn)假陽性等。對疫苗生產(chǎn)企業(yè)來說需要選擇一種靈敏度適合、特異性好、費用更低、操作更簡便、檢驗結(jié)果更穩(wěn)定的方法。本研究驗證的 PCR 法檢測疫苗用原輔料中豬源性病毒具有高效、省時的優(yōu)點，靈敏度和特異性也能達到我們的需求，可用于疫苗用原輔料中豬源性病毒快速檢測。

[1] Allan G, Krakowka S, Ellis J, et al. Discovery and evolving history of two genetically related but phenotypically different viruses, porcine circoviruses 1 and 2. Virus Res, 2012, 164(1-2):4-9.

[2] Sun SY, Wu D. Porcine parvovirus disease and research progress. Chin J Prev Vet Med, 2000, 22(s1):214-215. (in Chinese)

孫紹元, 吳丹. 豬細小病毒病及研究進展. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報, 2000, 22(s1):214-215.

[3] Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of the People’s Republic of China. Volume 3, 2015. Beijing: China Medical Science Press, 2015. (in Chinese)

國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典. 2015年版三部. 北京: 中國醫(yī)藥科技出版社, 2015.

[4] Huang M, Lv BL, Yuan LY, et al. Development and verification of a PCR assay for porcine circovirus in live attenuated Japanese encephalitis vaccine. Chin J Biol, 2016, 29(12):1346-1348, 1354. (in Chinese)

黃敏, 呂冰凌, 袁良玉, 等. 乙型腦炎減毒活疫苗中豬圓環(huán)病毒PCR檢測方法的建立及驗證. 中國生物制品學(xué)雜志, 2016, 29(12): 1346-1348, 1354.

[5] Qian XL, Ren FF, Song CH, et al. Development and verification of a PCR assay for porcine circovirus in vaccines for human use and cells used for production. Chin J Biol, 2018, 31(5):543-546, 551. (in Chinese)

錢興麗, 任芳芳, 宋彩花, 等. 人用疫苗及生產(chǎn)用細胞中豬圓環(huán)病毒PCR檢測方法的建立及驗證. 中國生物制品學(xué)雜志, 2018, 31(5): 543-546, 551.

[6] Han Y, Guo ZL, Li W, et al. The study of verification of the qualitative method for GMO foods. J Inspection Quarantine, 2017, 27(1):5-9. (in Chinese)

韓玥, 郭錚蕾, 李偉, 等. 食品轉(zhuǎn)基因定性檢測的方法驗證研究. 檢驗檢疫學(xué)刊, 2017, 27(1):5-9.

[7] Jiang LL, Wang XL, Wang HL, et al. Discussion of the performance verification procedures of the real-time quantitative polymerase chain reaction for determination of virus nucleic acid. J Mol Diagn Ther, 2012, 4(5):321-325. (in Chinese)

蔣玲麗, 王雪亮, 王華梁, 等. 實時熒光定量PCR檢測病毒核酸方法學(xué)性能驗證程序的探討. 分子診斷與治療雜志, 2012, 4(5):321- 325.

[8] Wang J, Lv BL, Meng L, et al. Method of loop mediated thermostatic amplification (LAMP) for detection of mycobacteria in Japanese encephalitis attenuated live vaccine was established//Proceedings of the 2013 China biological products annual conference and the 13th national symposium on biological products. Shanghai, 2013:185-189. (in Chinese)

王靜, 呂冰凌, 孟麗, 等. 乙型腦炎減毒活疫苗質(zhì)控中建立環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增法(LAMP)檢測分枝桿菌//2013中國生物制品年會暨第十三次全國生物制品學(xué)術(shù)研討會論文集. 上海, 2013:185-189.

[9] Victoria JG, Wang C, Jones MS, et al. Viral nucleic acids in live-attenuated vaccines: detection of minority variants and an adventitious virus. J Virol, 2010, 84(12):6033-6040.

[10] Mcclenahan SD, Krause PR, Uhlenhaut C. MolecuLar and infectivity studies of porcine circovirus in vaccines. Vaccine, 2011, 29(29-30): 4745-4753.

“重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項（2018ZX09738003）

李娜，Email：115735267@qq.com

2019-03-20

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.04.016