孫彬裕，曲守方，于婷，孫楠，孫晶，胡澤斌，黃杰

抗A抗B血型定型試劑（單克隆抗體）國家參考品的建立

孫彬裕*，曲守方*，于婷，孫楠，孫晶，胡澤斌，黃杰

100050 北京，中國食品藥品檢定研究院體外診斷試劑檢定所

ABO 血型系統(tǒng)是人類第一個血型系統(tǒng)，也是人類血型系統(tǒng)中抗原免疫性最強的[1]。至今人們已發(fā)現(xiàn)紅細胞上有 36 個血型系統(tǒng)，300 多種血型抗原。ABO 血型系統(tǒng)是臨床輸血和器官移植中最重要的血型系統(tǒng)，對獻血者和受血者 ABO 血型的預先確認是輸血工作中最為重要的實驗，錯誤的 ABO 血型定型將導致嚴重的輸血反應[2-3]?！堆炯夹g操作規(guī)程》（2015 版）對血型檢測項目規(guī)定的強制檢測項目就是ABO 正確定型[4]。ABO 血型鑒定必須同時進行正反定型試驗，使兩者的檢測結果相互驗證，才算定型正確。正定型是用已知的抗 A 和抗 B 血型定型試劑測定紅細胞上有無相應的 A 抗原或（和）B 抗原；反定型是用已知 ABO 血型的紅細胞測定血清中有無相應的抗 A 抗體或（和）抗 B 抗體[5]?？?A 抗 B 血型定型試劑（單克隆抗體）是按照生物制品管理的用于血液篩查的體外診斷試劑產(chǎn)品，目前需要批簽發(fā)。國家藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)批準了 8 個國內(nèi)外不同公司的抗 A 抗 B 血型定型試劑（單克隆抗體），應用于正定型鑒定 ABO 血型。

抗 A 抗 B 血型定型試劑（單克隆抗體）進行效價測定時，可能會因為不同實驗者試驗方法和主觀判斷等因素，影響實驗結果。目前國際通用的方法是制備統(tǒng)一的參考品用來限定血型定型試劑產(chǎn)品的最低效價，要求試劑的效價應不低于參考品的效價[6]。《中華人民共和國藥典》（2015 年版）三部明確規(guī)定了正定型類抗 A 抗 B 血型定型試劑（單克隆抗體）的通則，并要求其對紅細胞的凝集效價應不低于國家參考品的同步測定結果[7]。因此本實驗室開展了抗 A 抗 B 血型定型試劑國家參考品的研制工作，該參考品可以規(guī)范抗 A 抗 B 血型定型試劑效價的檢測，促進測定結果標準化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料 抗 A 雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液（細胞株為 SRBC-B3 和 9113D10）和抗 B 雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液（細胞株為 SRBC-C 和 9621A8），效價為 1:2048，由上海血液生物醫(yī)藥有限責任公司提供。

1.1.2 儀器 90-1 型恒溫磁力攪拌器購自上海精科實業(yè)有限公司；QL-901 型漩渦混合器購自海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Microlab?540B 配液儀購自瑞士 Hamilton 公司；DT5-3 血型離心機購自北京時代北利離心機有限公司；YB-IIA 型澄明度檢測儀購自天津市精拓儀器科技有限公司。

1.1.3 試劑 紅細胞為 3 d 內(nèi)新鮮采集的紅細胞。

1.2 方法

1.2.1 制備及檢測

1.2.1.1 制備 將原料抗 A 雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液和抗 B 雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液加入等體積的賦形劑（蔗糖溶液），充分混勻后，配制成參考品候選品溶液，置于 2 ~ 8 ℃過夜。次日經(jīng) 0.22 μm 濾膜無菌過濾，按每支安瓿 1.0 ml 進行分裝。凍干制備成抗 A 抗 B 血型定型試劑國家參考品。

1.2.1.2 檢測 實驗室按照《中華人民共和國藥典》（2015 年版）三部要求，對抗 A 抗 B 血型定型試劑國家參考品進行外觀、特異性、親和力、效價、冷凝集素和不規(guī)則抗體等項目的檢測。

外觀：參考品使用時應先用 1.0 ml 去離子水將內(nèi)容物完全復溶，再加入 5.0 ml 2% 牛血清白蛋白生理鹽水配制成標準液備用。選擇 2200 光照度（lx），手持瓶頸部于遮光板邊緣處，輕輕旋轉和翻轉容器使藥液中可能存在的可見異物懸浮（注意不使藥液產(chǎn)生氣泡），在明視距離（供試品至人眼的清晰觀察距離，通常為 25 cm）分別在黑色和白色背景下目測 20 s，肉眼觀察液體情況。

特異性：取試管排 2 行，每行4 支試管，每行分別加入抗 A 血型試劑國家參考品和生理氯化鈉 0.1 ml，每列分別加入2% A1、A2B、B、O 型紅細胞懸液 0.1 ml；取試管排 2 行，每行3 支試管，每行分別加入待檢抗 B 血型試劑國家參考品和生理鹽水 0.1 ml，每列分別加入2%A1、B、O 型紅細胞懸液 0.1 ml。置 18 ~ 25 ℃ 15 min，經(jīng)1000 r/min 離心 1 min，肉眼觀察凝集結果。

親和力：將待檢抗 A 血型試劑國家參考品 0.05 ml 置潔凈玻片上，加入等體積10% A1、A2、A2B 型紅細胞懸液；將待檢抗 B 血型試劑國家參考品 0.05 ml 置潔凈玻片上，加入等體積10% B 型紅細胞懸液。立即混勻，滴入紅細胞懸液同時記錄肉眼可見凝集出現(xiàn)時間以及凝塊大小。

效價：取試管排成2 排，每排10 支，自第一管起每支各加生理氯化鈉溶液0.1 ml，加待檢試劑0.1 ml，2 倍系列稀釋，然后加2% 相應紅細胞懸液0.1 ml，搖勻，于18 ~ 25 ℃放置 15 min，經(jīng) 1000 r/min 離心 1 min，同時用生理氯化鈉溶液做紅細胞懸液對照。效價以產(chǎn)生“+”凝集的待檢試劑最高稀釋度計算，不計紅細胞懸液體積，2 排試管終點相同作為待檢試劑凝集效價，如果 2 排試管終點相差 1 管，則以凝集效價低的判為終點，如 2 排試管終點相差 2 管或以上，需重新進行標定實驗。

冷凝集素和不規(guī)則抗體測定：隨機取 10 例非血緣性 O 型紅細胞、3 例A 型紅細胞和 3 例 B 型紅細胞，分別用生理氯化鈉溶液配成 2% 紅細胞懸液，用 20% 牛白蛋白生理氯化鈉溶液配成 5% 紅細胞懸液。每一待檢試劑排3 排試管，每排 13 支，各加待檢試劑 0.1 ml，前 10 管分別加入 O 型 2% 紅細胞懸液 0.1 ml，后 3 管分別加入B 型 2% 紅細胞懸液 0.1 ml（測待檢抗 A 試劑）或者加入A 型2% 紅細胞懸液 0.1 ml（測待檢抗 B 試劑），第一排置 4 ℃，第二排置 18 ~ 25 ℃，第三排置 37 ℃，靜置 2 h。牛白蛋白介質(zhì)按上法進行，排成兩排，分別置 18 ~25 ℃及 37 ℃，靜置 2 h，觀察凝集結果。

1.2.2 瓶間精密度實驗 隨機抽取 2 支抗 A 抗 B 血型定型試劑國家參考品，各協(xié)作標定實驗室按照《中華人民共和國藥典》（2015 年版）三部要求檢測試劑效價和親和力，平行進行分析測定，并統(tǒng)計結果。

1.2.3 熱穩(wěn)定性實驗 隨機抽取抗 A 抗 B 血型定型試劑國家參考品進行穩(wěn)定性試驗。將國家參考品置 37 ℃放置 3、7、14 d 后，各協(xié)作標定實驗室檢測效價和親和力。以–20 ℃保存的國家參考品（記為 0 周）為對照，對熱穩(wěn)定性的國家參考品平行進行分析測定。

1.2.4 效價協(xié)作標定結果 四家協(xié)作標定實驗室按照《中華人民共和國藥典》（2015 年版）三部要求檢測試劑效價，平行進行分析測定，并統(tǒng)計效價結果，確定抗 A 抗 B 血型定型試劑國家參考品的效價。

2 結果

2.1 國家參考品檢測結果

外觀檢測：抗 A 血型定型試劑國家參考品為藍色凍干粉末，抗 B 血型定型試劑國家參考品為黃色凍干粉末。復溶后外觀抗 A 血型定型試劑國家參考品為藍色透明液體、抗 B 血型定型試劑國家參考品為黃色透明液體，均無搖不散的沉淀和異物。特異性檢測：抗 A 血型試劑國家參考品與 A1、A2B 型紅細胞凝集，與 B、O 型紅細胞不凝集，沒有溶血等不易分辨的現(xiàn)象；抗 B 血型試劑國家參考品與 B 紅細胞產(chǎn)生凝集，與 A1、O 型紅細胞不產(chǎn)生凝集，沒有溶血等不易分辨的現(xiàn)象。親和力檢測：與相應的紅細胞的凝集時間均在 15 s 以內(nèi)，3 min 凝集塊 > 1 mm2。效價檢測：抗 A 血型定型試劑國家參考品結果為對 A1 細胞 1:256，對 A2 細胞 1:128，對 A2B 細胞 1:128，抗 B 血型定型試劑國家參考品結果為對 B 細胞 1:256，見表 1。冷凝集素和不規(guī)則抗體檢測的結果均為無凝集反應或溶血現(xiàn)象。各項結果均符合《中華人民共和國藥典》（2015 年版）中的規(guī)定。

2.2 瓶間精密度實驗結果

按照《中華人民共和國藥典》（2015 年版）三部要求，對抗 A 抗 B 血型定型試劑國家參考品的效價和親和力進行檢測，結果均為對 A1細胞的效價 1:256，對 A2細胞的效價為 1:128，對 A2B 細胞的效價為 1:128，對 B 細胞的效價為 1:256，結果表明瓶間效價無顯著差異。

表 1 熱穩(wěn)定性實驗結果

續(xù)表 1

2.3 熱穩(wěn)定性實驗結果

將國家參考品在 37 ℃放置 3、7、14 d 后，進行效價和親和力檢測，并與–20 ℃保存的國家參考品（作為0 周）效價比較，效價一致且均未下降，親和力的結果也符合藥典的要求，即相應的紅細胞的凝集時間均在 15 s 以內(nèi)（表 1），3 min 凝集塊> 1 mm2。實驗結果表明國家參考品非常穩(wěn)定。

對各協(xié)作標定實驗室的標定結果進行統(tǒng)計分析和匯總，見表 2。效價為抗 A 血型定型試劑國家參考品對 A1細胞 1:256，對 A2細胞 1:128，對 A2B 細胞 1:128，抗 B 血型定型試劑國家參考品對 B 細胞 1:256。

表 2 協(xié)作標定結果

3 討論

ABO 血型是人類穩(wěn)定的遺傳標志物，ABO 抗原不僅存在于紅細胞膜上，也廣泛存在于人體的體液和分泌液中。傳統(tǒng)的 ABO 分型是采用血清學方法。ABO 血型鑒定的原理基于抗原和抗體反應所產(chǎn)生的細胞凝集，通過正定型（細胞定型試驗）和反定型（血清定型試驗），判定 ABO 血型。而正定型的抗 A 抗 B 血型定型試劑的效價是該產(chǎn)品一項重要的技術指標。但是各家產(chǎn)品測定結果有明顯的差異性，所以研制抗 A 抗 B 血型定型試劑國家參考品能規(guī)范抗 A 抗 B 血型定型試劑效價的檢測。

體外診斷試劑質(zhì)量的提高有賴于國家標準物質(zhì)水平的提高和完善。產(chǎn)品注冊檢測工作中如果缺乏統(tǒng)一的國家參考品，檢測時只能由企業(yè)提供自己的參考品。如果缺乏統(tǒng)一的尺度，勢必給試劑盒的注冊和上市后的監(jiān)管工作帶來很大的影響。為了加強抗 A 抗 B 血型定型試劑（單克隆抗體）質(zhì)量的控制，迫切需要建立用于效價評價用的國家參考品，以便對市場上的抗 A 抗 B 血型定型試劑進行科學合理的監(jiān)管。建立的抗 A 抗 B 血型定型試劑（單克隆抗體）國家參考品，可以用于評價試劑盒的效價評價，對于提高產(chǎn)品的質(zhì)量具有十分重要的意義。

抗 A 抗 B 血型定型試劑（單克隆抗體）是按照生物制品管理的體外診斷試劑產(chǎn)品，在《中華人民共和國藥典》（2015 年版）三部里面對該產(chǎn)品的外觀、特異性、親和力、效價、冷凝集素和不規(guī)則抗體檢測進行了詳細的規(guī)定，并要求其對紅細胞的凝集效價應不低于國家參考品的同步測定結果。因此對該產(chǎn)品進行效價檢測時，必須同步使用國家參考品進行檢測。而國家參考品效價的準確標定，影響著該類產(chǎn)品的質(zhì)量評價。研究報道，不同實驗室雖然使用相同的實驗方法，但是由于不同實驗人員的操作方式以及對凝集結果的主觀判斷、不同批次的紅細胞表面抗原的差異等因素，可能會影響效價的結果[8]。為了避免紅細胞的影響因素，我們建議各個協(xié)作標定單位使用 3 d 內(nèi)新鮮采集的紅細胞進行檢測?？?A 抗 B 血型定型試劑（單克隆抗體）國家參考品經(jīng)中國食品藥品檢定研究院、上海血液生物醫(yī)藥有限責任公司、長春博德生物技術有限公司和北京金豪制藥股份有限公司四家單位協(xié)作標定，效價均為對 A1細胞的效價 1:256，對 A2細胞的效價為 1:128，對 A2B 細胞的效價為 1:128。國家參考品的瓶間精密度結果為各瓶的效價均一致，表明瓶間無顯著差異。將國家參考品在 37 ℃放置3、7、14 d 后，與–20 ℃保存的國家參考品效價比較，效價均未下降，表明國家參考品穩(wěn)定性很好。該國家參考品已經(jīng)于 2018 年開始使用，效價穩(wěn)定，能夠滿足抗 A 抗 B 血型定型試劑效價的評價要求。我們同時將對該國家參考品進行長期穩(wěn)定性研究以及期間核查，以確保長期放置后的效價依然滿足國家參考品的要求。

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*同為第一作者

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.04.015

黃杰，Email：jhuang5522@126.com；胡澤斌，Email：huzbcmba@163.com

2019-02-11