李星論，鞏婷，陳晶晶，陳天嬌，喬云明，楊金玲，朱平

重組人源超氧化物歧化酶研究進(jìn)展

李星論，鞏婷，陳晶晶，陳天嬌，喬云明，楊金玲，朱平

100050 北京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院天然藥物活性物質(zhì)與功能?chē)?guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家衛(wèi)健委天然藥物生物合成重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室<

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是動(dòng)物、植物和微生物中普遍存在的一類(lèi)酶，是生物抗氧化系統(tǒng)的第一道防線(xiàn)，也是體內(nèi)唯一能夠特異性清除氧自由基的抗氧化酶。SOD 為金屬酶，按其結(jié)合的金屬離子種類(lèi)不同，目前已知的 SOD 主要分為三類(lèi)，即 Cu/Zn-SOD（SOD1）、Mn-SOD（SOD2）和 Fe-SOD（SOD3）[1]。人體內(nèi)外源化合物在各種酶的作用下會(huì)產(chǎn)生氧自由基，氧自由基在 SOD 的催化作用下轉(zhuǎn)變?yōu)檫^(guò)氧化氫，體內(nèi)的過(guò)氧化氫酶（CAT）和過(guò)氧化物酶（POD）會(huì)立即將其分解為完全無(wú)害的水（圖 1）。當(dāng)生物體沒(méi)有足夠多的 SOD 時(shí)，活性氧將會(huì)大量累積，如不能及時(shí)清除就會(huì)引發(fā)氧化損傷，導(dǎo)致機(jī)體損害，比如堿基突變、DNA 鏈斷裂、膜脂過(guò)氧化和蛋白質(zhì)損傷等，從而加速衰老或?qū)е录膊2]。除了抗氧化作用外，SOD 還具有抗炎[3]、抗腫瘤[4]及調(diào)控免疫[5]等重要作用，并且在免疫防御中起殺死病毒的作用[6]。SOD 具有廣泛的醫(yī)療價(jià)值，臨床上可用 SOD 治療和預(yù)防急性炎癥和水腫、氧中毒、肺氣腫、輻射病、老年性白內(nèi)障及衰老等。此外，SOD 還可以作為食品和化妝品的添加劑。

國(guó)外主要從牛羊等動(dòng)物的血液中提取SOD，國(guó)內(nèi)主要從豬的血液中提取 SOD[7]。動(dòng)物來(lái)源的 SOD 存在與人交叉感染、過(guò)敏性反應(yīng)等不良現(xiàn)象。此外，因?yàn)榀偱２〉戎虏∫蜃拥膫鞑?，從?dòng)物血液中提取SOD 的安全性受到嚴(yán)重質(zhì)疑。歐盟于 1999 年已禁止將動(dòng)物來(lái)源的 SOD 用于人類(lèi)醫(yī)療和保健。但因?yàn)閺膭?dòng)物血液中提取 SOD 成本低、工藝簡(jiǎn)單，至今無(wú)法全面禁止[8]。天然 SOD 在應(yīng)用方面有其局限性：①半衰期短（5 ~ 10 min），代謝迅速[9]；②異源性——由于天然 SOD 的制劑多來(lái)源于動(dòng)物或微生物，對(duì)人體來(lái)說(shuō)存在免疫原性問(wèn)題[10]；③不易透皮或透膜，吸收困難。天然 SOD 屬于大分子蛋白，在細(xì)胞膜上沒(méi)有專(zhuān)一受體，難以迅速進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用[11]。多年來(lái)人們一直不斷嘗試各種方法來(lái)獲取 SOD 并改造其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，從而拓展其應(yīng)用范圍。常用的方法有化學(xué)修飾法[12]、SOD 模擬化合物[13]和基因工程法[14]等，其中通過(guò)基因工程技術(shù)獲取和改造 SOD 的相關(guān)研究發(fā)展尤為迅速。1983 年，Sherman 等[15]首次克隆得到人源 Cu/Zn-SOD（hCu/Zn-SOD）的 cDNA 序列，為通過(guò)基因工程獲取和改造 SOD 奠定了基礎(chǔ)。近年來(lái)，科

圖 1 SOD 的作用機(jī)制（GSH：還原型谷胱甘肽；GSSG：氧化型谷胱甘肽；PHS：前列腺素合成酶；LPO：脂質(zhì)過(guò)氧化物；NAD+：輔酶 I；NADPH：還原型輔酶 II；G-6-P：6-磷酸葡萄糖；G-6-PDH：6-葡萄糖磷酸脫氫酶；6-phosphogluconate：6-磷酸葡萄糖酸酯）學(xué)家們通過(guò)基因工程技術(shù)，并結(jié)合細(xì)胞工程、酶工程、蛋白質(zhì)工程和微生物工程等技術(shù)，大大推動(dòng)了重組 SOD 在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。目前，基因工程在工業(yè)化生產(chǎn) SOD 中的地位愈發(fā)重要，與化學(xué)修飾法和 SOD 模擬化合物方法相比，基因工程廣開(kāi)酶源，潛力巨大，是降低 SOD 生產(chǎn)成本和獲得無(wú)抗原性人源 SOD 的有效途徑[16]。

目前，關(guān)于 SOD 的綜述有很多，研究者們分別從 SOD 的來(lái)源、分類(lèi)、功能和催化機(jī)理等方面進(jìn)行了總結(jié)，并列舉了 SOD 在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、化妝品和食品開(kāi)發(fā)等方面的應(yīng)用現(xiàn)狀及前景[16]。本文重點(diǎn)綜述了重組人源 SOD 的研究策略與進(jìn)展，以期為 SOD 的理論研究與實(shí)際應(yīng)用提供參考。

1 表達(dá)系統(tǒng)的選擇

選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)是決定重組人源 SOD 高效表達(dá)的重要因素（表 1）。在選擇蛋白表達(dá)系統(tǒng)時(shí)，需要考慮的主要因素是蛋白活性、可溶性、得率及培養(yǎng)周期等。

1.1 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)

在各種表達(dá)系統(tǒng)中，最早開(kāi)展研究的是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，它也是目前最成熟的表達(dá)系統(tǒng)。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有遺傳背景清楚、表達(dá)量高、繁殖快、成本低、穩(wěn)定性好、抗污染能力強(qiáng)和產(chǎn)物容易純化等優(yōu)點(diǎn)[17]。張弘浩等[18]將人源 SOD 基因?qū)氪竽c桿菌，得到包涵體形式的重組蛋白，經(jīng)過(guò)尿素處理、透析，重組蛋白由包涵體轉(zhuǎn)化為可溶性蛋白。研究指出 Cu2+、Zn2+的加入對(duì)于恢復(fù) SOD 的活性和穩(wěn)定性是必不可少的，且適當(dāng)提高溫度將大大縮短復(fù)性時(shí)間，獲得的重組人源 SOD 比活力可達(dá)到 6000 U/mg 以上。Zhu 等[19]克隆了人源胞外超氧化物歧化酶（human extracellular superoxide dismutase，hEC-SOD）的 cDNA，并在大腸桿菌中進(jìn)行了重組表達(dá)，得到包涵體形式的重組蛋白。通過(guò)尿素處理獲得可溶性蛋白，并通過(guò)固定化金屬親和層析柱對(duì)重組 hEC-SOD 進(jìn)行逐步復(fù)性，得到了正確折疊的二聚體蛋白和單體蛋白，兩種蛋白的比活力分別為 3475 U/mg 和 510 U/mg，二聚體的活性明顯高于單體。

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)雖有許多優(yōu)點(diǎn)，但存在蛋白不能正確折疊、易形成包涵體、密碼子體系與真核生物差別較大、翻譯后修飾不完善和內(nèi)毒素等應(yīng)用瓶頸。

1.2 酵母表達(dá)系統(tǒng)

酵母表達(dá)系統(tǒng)可高水平表達(dá)蛋白，并具有翻譯后修飾功能，兼具原核與真核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)，因此在基因工程領(lǐng)域中得到日益廣泛的應(yīng)用。其中甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的酵母表達(dá)系統(tǒng)，并以畢赤酵母應(yīng)用最多。釀酒酵母分泌外源蛋白效率低，且大規(guī)模發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生的乙醇會(huì)影響菌體自身生長(zhǎng)，因此難以進(jìn)行高密度發(fā)酵[20]。林士森等[21]將 hEC-SOD 在畢赤酵母中表達(dá)，從上清液中獲得重組蛋白，經(jīng)純化后測(cè)得重組蛋白的比活力為 1700 U/mg。鄭屹峰等[22]以表達(dá) hCu/Zn-SOD 的重組畢赤酵母為出發(fā)菌株，采用甲醇-甘油混合飼喂的方法進(jìn)行 5 L 發(fā)酵罐高密度發(fā)酵培養(yǎng)，最終獲得的重組 hCu/Zn-SOD 比活力達(dá)到 13 539 U/ml。畢赤酵母表達(dá)體系表達(dá)的重組蛋白能夠直接分泌至胞外，故有利于工業(yè)化分離與純化，其表達(dá)的蛋白能夠形成二硫鍵、進(jìn)行糖基化修飾等，且表達(dá)量高[23]。然而，畢赤酵母表達(dá)體系不足之處在于使用甲醇作為誘導(dǎo)劑，具有一定危害，且糖基化與哺乳動(dòng)物細(xì)胞有所不同。

1.3 植物表達(dá)系統(tǒng)

植物表達(dá)系統(tǒng)能夠表達(dá)來(lái)自病毒、細(xì)菌和動(dòng)物等的蛋白，易于大規(guī)模培養(yǎng)與生產(chǎn)，在基因表達(dá)及修飾方面也有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。目前已在煙草、水稻、紅花和馬鈴薯等植物中實(shí)現(xiàn)了許多外源蛋白的表達(dá)[24]。由于煙草具有生物產(chǎn)量高、轉(zhuǎn)化簡(jiǎn)單、不進(jìn)入食物鏈及生物安全風(fēng)險(xiǎn)小等優(yōu)勢(shì)，因此成為目前發(fā)展最成熟的植物表達(dá)體系。Park 等[25]通過(guò)植物瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)在煙草葉細(xì)胞中表達(dá)出具有催化活性的重組hEC-SOD，為植物表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)重組 SOD 開(kāi)啟了新的大門(mén)。但由于利用植物表達(dá)生產(chǎn)外源蛋白相關(guān)技術(shù)起步較晚，部分技術(shù)并非特別成熟，因此目前利用植物系統(tǒng)生產(chǎn)目的蛋白與其他系統(tǒng)相比尚不具備競(jìng)爭(zhēng)力[26]。

1.4 昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)

20 世紀(jì) 80 年代起，以桿狀病毒為載體的外源基因表達(dá)體系日趨成熟，極大促進(jìn)了昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的發(fā)展。昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)既能表達(dá)原核基因也能表達(dá)真核基因，并兼具了原核表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)量高和真核表達(dá)系統(tǒng)蛋白翻譯后修飾的優(yōu)點(diǎn)。昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)載體采用了昆蟲(chóng)核型多角體病毒（multiple nuclear polyhedrosis virus，MNPV）中多角體蛋白基因（polyhedrin gene，phg）的強(qiáng)啟動(dòng)子，可以實(shí)現(xiàn)很多真核蛋白的有效表達(dá)。常用的宿主細(xì)胞則來(lái)源于草地貪夜蛾的 Sf-9 和 Sf-21 細(xì)胞系[27]。范立強(qiáng)等[28]將 hEC-SOD 基因插入昆蟲(chóng)桿狀病毒供體質(zhì)粒 pFastBacHTb 中，再將其轉(zhuǎn)染粉紋夜蛾細(xì)胞 Tn-5B1-4，SDS-PAGE 和 Western blot 結(jié)果顯示 hEC-SOD 在粉紋夜蛾細(xì)胞中成功表達(dá)，其細(xì)胞裂解物中的hEC-SOD比活力為 260 U/mg。Shrestha 等[29]將全長(zhǎng)和截短的 hEC-SOD 基因分別克隆到供體質(zhì)粒 pFastBacHTb，并轉(zhuǎn)染到 SF9 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，也成功表達(dá)出了有活性的全長(zhǎng)和截短的 hEC-SOD，且 Western blot 顯示重組 hEC-SOD 同時(shí)以單體（33 kD）和二聚體（66 kD）形式存在。

昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)可以同時(shí)表達(dá)數(shù)個(gè)外源基因，在生產(chǎn)蛋白復(fù)合體時(shí)尤其有效。目前，昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于疫苗生產(chǎn)和重組病毒殺蟲(chóng)劑等眾多領(lǐng)域。但由于鱗翅類(lèi)昆蟲(chóng)的蛋白加工路徑和高等真核生物不同，且桿狀病毒感染可能對(duì)宿主的蛋白加工具有負(fù)面影響，因此其應(yīng)用還存在一定的限制。

1.5 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)

一般通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或病毒載體感染的方法在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)外源蛋白。利用病毒表達(dá)體系可以快速感染細(xì)胞，在幾天內(nèi)使外源基因整合到病毒載體中，而利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞則需要幾周甚至幾個(gè)月時(shí)間。Lu 等[30]采用編碼 hCu/Zn-SOD 和 hEC-SOD 的兩個(gè)序列，以及山羊 β-酪蛋白的 5' 端和 3' 端的調(diào)控元件，構(gòu)建了乳腺特異性表達(dá)載體，通過(guò)共轉(zhuǎn)染法制備山羊胚胎成纖維細(xì)胞作為供體細(xì)胞，Western blot 檢測(cè)顯示重組 hCu/Zn-SOD 和 hEC-SOD 在轉(zhuǎn)雙基因山羊乳腺中均有表達(dá)。聯(lián)合酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）顯示，重組 hCu/Zn-SOD 的表達(dá)量為 100.14 mg/L，重組 hEC-SOD 的表達(dá)量為 279.10 mg/L。酶活性測(cè)定結(jié)果顯示，羊奶中重組 hCu/Zn-SOD 和 hEC-SOD 的總生物活性為 1451 U/ml。這些結(jié)果證明了哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有生產(chǎn)重組 SOD 的潛力。

表 1 不同系統(tǒng)表達(dá)的重組人源 SOD 比活力比較

2 通過(guò)基因突變改善 SOD 的性能

hCu/Zn-SOD 作為抗氧化酶能夠減輕活性氧自由基對(duì)細(xì)胞的損傷，且不會(huì)引起免疫反應(yīng)，但是hCu/Zn-SOD 的大規(guī)模生產(chǎn)和臨床使用受到產(chǎn)量和可溶性的限制。通過(guò)定點(diǎn)突變改變 hCu/Zn-SOD 的一些氨基酸殘基可以改善其產(chǎn)量和品質(zhì)。

hCu/Zn-SOD 包含 2 個(gè)亞基，每個(gè)亞基又包含 4 個(gè)半胱氨酸（Cys）殘基，其對(duì)應(yīng)的位置分別是 6、57、111 和 146，其中 Cys57 和 Cys146 之間形成分子內(nèi)二硫鍵，6 位和 111 位是游離的半胱氨酸殘基。周贊虎等[36]應(yīng)用 PCR 定點(diǎn)突變技術(shù)把 hCu/Zn-SOD 基因的 Cys111密碼子突變?yōu)?Ala111密碼子，通過(guò)隨機(jī)同源重組將突變后的 hCu/Zn-SOD 整合到聚球藻sp. PCC7942 中并實(shí)現(xiàn)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物在 80 ℃保溫 30 min 后仍具有 95% 的活力，耐熱能力比天然 hCu/Zn-SOD 有了較大的提高。張琨等[37]通過(guò)重疊 PCR 技術(shù)將天然 hCu/Zn-SOD 基因的 Cys6密碼子突變?yōu)?Ala6密碼子，Cys111密碼子突變?yōu)?Ser111密碼子，通過(guò)大腸桿菌重組表達(dá)得到改構(gòu)體蛋白 rmhCu/Zn-SOD6Ala,111Ser，從 1 g 濕菌體中獲得的活性蛋白總量高于未改構(gòu)體的 2 倍，改構(gòu)體的熱穩(wěn)定性也獲得大幅度提高。高淑彬[38]分別構(gòu)建天然 hCu/Zn-SOD 和 Cys111突變成 Ala111的突變 hCu/Zn-SOD 表達(dá)載體，并在大腸桿菌中表達(dá)，其表達(dá)量都占菌體總蛋白的 45%以上，突變 hCu/Zn-SOD 酶活力和穩(wěn)定性均高于天然 hCu/Zn-SOD，證明通過(guò)基因突變可以改善酶的性能。通過(guò)隨機(jī)整合方式將突變的 hCu/Zn-SOD 基因整合到藍(lán)藻sp.PCC7942 染色體上，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明轉(zhuǎn)突變 hCu/Zn-SOD 基因的藍(lán)藻口服后具有較強(qiáng)的抗氧化作用，為進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)半衰期長(zhǎng)的可直接口服的 hCu/Zn-SOD 奠定了基礎(chǔ)。Zhang 等[39]將 hCu/Zn-SOD 的 6 位和 111 位的半胱氨酸（C）突變?yōu)榻z氨酸（S），構(gòu)建了 3 個(gè)突變體 mhSOD1/C6S、mhSOD1/C111S 和 mhSOD1/C6S/C111S。結(jié)果表明，與野生型相比，除了 C6S 突變使重組蛋白可溶性表達(dá)降低以外，C111S 和 C6S/C111S 突變均能增加重組蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)，進(jìn)而提高重組蛋白的產(chǎn)量，且 C111S 突變效果優(yōu)于 C6S/C111S。此外，mhSOD1/C111S 顯示了更低的毒性和更強(qiáng)的美白和抗輻射活性。因此，C111S 突變是工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)和開(kāi)發(fā)重組人源 SOD 的一個(gè)有效策略。

3 通過(guò)融合蛋白技術(shù)改善 SOD 的性能

融合蛋白技術(shù)是指利用基因工程技術(shù)，將兩段或多段編碼功能蛋白的基因有目的地連接在一起并進(jìn)行表達(dá)，從而產(chǎn)生一種新的人工融合蛋白的方法。由相對(duì)較小的結(jié)構(gòu)域拼裝成較大的多功能蛋白是自然進(jìn)化的一個(gè)重要因素。因此，在基因水平上將不同的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行連接，并且使其表達(dá)成融合蛋白，是形成多功能蛋白、降低原蛋白毒副作用及改造天然蛋白的重要方法。由于有新功能蛋白加入，融合蛋白的性能被優(yōu)化，并產(chǎn)生新的生物功能和活性，所以這種新型的人工蛋白具有重要的理論意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值[40]。

3.1 PTD-SOD 融合蛋白

細(xì)胞膜上沒(méi)有專(zhuān)一的 SOD 通道或受體，外源 SOD 難以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮抗氧化作用，因而限制了其臨床應(yīng)用[11]。HIV-1 反式激活蛋白 TAT 的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域（protein transduction domain，PTD）是一種廣譜的能攜帶大分子物質(zhì)穿透動(dòng)物細(xì)胞膜的小分子多肽，可以解決 SOD 蛋白透膜相關(guān)難題。PTD 可以引導(dǎo)多種多肽和蛋白進(jìn)入目標(biāo)細(xì)胞，具有轉(zhuǎn)導(dǎo)速度快、效率高和溫度適應(yīng)性廣等優(yōu)點(diǎn)，且能夠透過(guò)血腦屏障[41]。大部分 PTD 或與 PTD 共價(jià)結(jié)合的蛋白在跨過(guò)細(xì)胞膜后轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核而不是細(xì)胞質(zhì)或其他細(xì)胞器，因此PTD 運(yùn)輸系統(tǒng)只適用于在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮功能的藥物分子的轉(zhuǎn)運(yùn)[42]。王宇等[43]研究 PTD4 介導(dǎo)的 Cu/Zn-SOD 對(duì)大鼠心肌細(xì)胞缺氧-復(fù)氧損傷（HRI）的影響，發(fā)現(xiàn)重組的 PTD4-Cu/Zn-SOD 融合蛋白可以明顯減少 HRI 導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，從而減輕大鼠心肌細(xì)胞的 HRI，證明了重組 PTD4-Cu/Zn-SOD 可以高效穿透心肌細(xì)胞，改善心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷。Yao 等[44]在骨癌研究中發(fā)現(xiàn)，活性氧在一定程度上參與了腫瘤疼痛的發(fā)展和持續(xù)，而重組 PTD-Cu/Zn-SOD 可以減弱這種作用，因此其在骨癌治療中可作為一種潛在的輔助治療劑。Zhang 等[45]將所獲得的 Mn-SOD、PTD-Mn-SOD 和脂質(zhì)體 Mn-SOD 用于保護(hù)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）氧化損傷，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與天然 Mn-SOD 相比，PTD-Mn-SOD 和脂質(zhì)體 Mn-SOD 可發(fā)揮更強(qiáng)的藥理作用。孟麗華和薛榮亮[46]通過(guò)檢測(cè) PTD4-Cu/Zn-SOD 進(jìn)入人星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的熒光蛋白的分布情況，發(fā)現(xiàn) PTD4-Cu/Zn-SOD 融合蛋白能夠穿過(guò)細(xì)胞膜，且可以降低因細(xì)胞缺氧損傷所致的細(xì)胞凋亡。PTD 與 SOD 進(jìn)行融合的方法簡(jiǎn)單易行，可提供大量廉價(jià)、安全、高活性的重組 SOD 制品。需要強(qiáng)調(diào)的是，盡管 PTD-Cu/Zn-SOD 融合蛋白具有良好的穿透細(xì)胞膜特性，但沒(méi)有組織特異性，若是靜脈給藥可能會(huì)迅速導(dǎo)入血管內(nèi)皮細(xì)胞或血細(xì)胞，不能很好地到達(dá)靶區(qū)發(fā)揮作用，因此需要進(jìn)一步改進(jìn)結(jié)構(gòu)或給藥途徑以解決其靶向問(wèn)題[47]。

3.2 PEP-SOD 融合蛋白

PEP-1 是一種人工設(shè)計(jì)的主要用于轉(zhuǎn)導(dǎo)大分子蛋白的細(xì)胞穿透肽（cell penetrating peptide，CPP），它能高效率地?cái)y帶具有治療效果的蛋白進(jìn)入細(xì)胞并發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。Liu 等[48]構(gòu)建了表達(dá) PEP-1-hMnSOD 融合蛋白的表達(dá)載體，并在雙歧桿菌中成功表達(dá)了 PEP-1-hMnSOD 融合蛋白。在進(jìn)一步臨床研究中，將透膜性和穩(wěn)定性較差的 hMnSOD 通過(guò) PEP-1 遞送到結(jié)腸炎癥細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)對(duì)炎癥細(xì)胞因子 TNF-α、IL-1β、IL-6 和 IL-8 水平以及結(jié)腸組織學(xué)損傷檢測(cè)，發(fā)現(xiàn) PEP-1-hMnSOD 融合蛋白能夠有效地減輕葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎。因此口服表達(dá) PEP-1-hMnSOD 融合蛋白的雙歧桿菌工程菌可作為治療潰瘍性結(jié)腸炎的新方法。

神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）移植已被證明是一種潛在的治療創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）的策略。Jia 等[49]探索 NSCs 移植配合 PEP-1-SOD1 共同治療大鼠腦缺血的可能性。體外實(shí)驗(yàn)證明，PEP-1-SOD1 能提高神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，與單獨(dú) NSCs 移植相比，PEP-1-SOD1 聯(lián)合 NSCs 移植策略對(duì)大鼠 TBI 后的功能恢復(fù)有明顯的促進(jìn)作用。Yoo 等[50]探討了Cu/Zn-SOD 對(duì)脂肪組織來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose tissue-derived mesenchymal stromal cells，Ad-MSCs）抗脊髓缺血損傷的促進(jìn)作用。結(jié)果顯示 PEP-1-SOD1 和 Ad-MSCs聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)一步增強(qiáng)了 Ad-MSCs 對(duì)神經(jīng)元缺血損傷的保護(hù)作用。相對(duì)于 PTD 融合蛋白，PEP 融合蛋白具有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。PTD 融合蛋白進(jìn)入細(xì)胞后，所攜帶的功能蛋白需要在細(xì)胞內(nèi)分子伴侶 HSP90 的幫助下重折疊才能發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，靶蛋白的生物活性依賴(lài)于細(xì)胞內(nèi) HSP90 的重折疊效率，因此 PTD 融合蛋白技術(shù)的臨床應(yīng)用受到了一定限制[51]。而 PEP 融合蛋白能夠直接攜帶具有生物活性的功能蛋白進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，同時(shí)它還具有轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高、無(wú)毒性及不受血清影響等優(yōu)勢(shì)，這使細(xì)胞穿透肽 PEP 在應(yīng)用上更具有潛力，可能成為更適合于蛋白治療的載體工具。

3.3 多功能融合蛋白

研究者們?cè)鴩L試將不同功能的蛋白與 SOD 進(jìn)行組合，將不同蛋白的優(yōu)勢(shì)和特點(diǎn)融合在一起，以賦予目的蛋白多種新的屬性和功能。周宇飛等[14]為了增強(qiáng)胸腺素 α1（Thyα1）的穩(wěn)定性和免疫功能，采用胸腺素 α1 與人源 SOD 融合的策略，構(gòu)建了 6His-hSOD-(G4S)1-Thyα1 和 6His-hSOD-(G4S)2-Thyα1 兩個(gè)融合基因，并在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)了高水平表達(dá)。重組表達(dá)的融合蛋白經(jīng)過(guò)進(jìn)一步純化后進(jìn)行了活性檢測(cè)，結(jié)果表明這兩個(gè)融合蛋白既有 SOD 的活性，又有 Thyα1 的活性。盛明明等[52]采用基因工程技術(shù)通過(guò)大腸桿菌制備一種兼具人源 SOD 和過(guò)氧化氫酶（CAT）活性的多功能融合蛋白 CAT-PTD-SOD，該融合蛋白大部分以兼具 SOD 和 CAT 活性的可溶形式存在。在 0.033 mol/L、甚至 0.067 mol/L 的 H2O2溶液中，SOD 活性在 20 min 內(nèi)無(wú)明顯下降，證明其具備抗氧化和分解過(guò)氧化氫的雙重作用。潘劍茹等[53]構(gòu)建了 SOD1 和穿膜肽 R9 的融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒 GST（谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶）-SOD1-R9，通過(guò)大腸桿菌 BL21（DE3）表達(dá)出具有雙效抗氧化功能的 GST-SOD1-R9 融合蛋白。該融合蛋白不僅能夠清除多余的活性氧自由基，而且還能夠修復(fù)或清除體內(nèi)已被氧化損傷的生物分子，并再生氧化損傷的含巰基蛋白。Pan 等[54]研究了 GST-TAT-SOD 對(duì)順鉑損傷細(xì)胞的保護(hù)作用，證明 GST-TAT-SOD 通過(guò)直接清除多余的細(xì)胞內(nèi)自由基和增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化防御，可以解除順鉑治療引起的生長(zhǎng)抑制和細(xì)胞凋亡，因此GST-TAT-SOD 可以作為順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的保護(hù)劑。此外，Pan 等[55]還通過(guò)小鼠全身X 射線(xiàn)輻射實(shí)驗(yàn)，表明雙功能 GST-TAT-SOD 對(duì) X 射線(xiàn)輻射所致?lián)p傷有一定的防護(hù)作用，能夠有效提高小鼠脾臟和肝臟的抗氧化能力、脾臟白髓數(shù)目和胸腺指數(shù)等，不僅顯著提高了X 射線(xiàn)輻照小鼠體重增長(zhǎng)率，而且提高了接受致死量照射小鼠的存活率。GST-TAT-SOD 的整體效果比阿米福汀好一些，所以 GST-TAT-SOD 可作為一種安全的輻射防護(hù)劑。Luangwattananun 等[56]設(shè)計(jì)并研制了三功能融合蛋白CAT-CuZnSOD/6His-CuZnSOD-TAT（CS/S-TAT），與其之前設(shè)計(jì)的 6His-MnSOD-TAT/CAT-MnSOD（M-TAT/CM）相比，分子大小減小 42%，其 SOD 和 CAT 活性分別提高 22% 和 99%。在 70 ℃孵育 10 min 后，CS/S-TAT 保留了 54% 的殘余 SOD 活性，而 M-TAT/CM 的 SOD 活性完全消除。此外，在 70 ℃時(shí)，CS/S-TAT 的半衰期比 M-TAT/CM 提高了 5 倍。該酶能夠跨膜進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，可作為氧化損傷細(xì)胞的保護(hù)劑或治療劑。因此，這項(xiàng)工作為設(shè)計(jì)和合成一種更穩(wěn)定的多功能抗氧化酶提供了參考?？傊?，多功能的融合蛋白在抗氧化方面，往往比單一的抗氧化蛋白具有更大的優(yōu)勢(shì)。因此，融合蛋白的巨大優(yōu)勢(shì)使其有望成為新一代抗氧化藥物的有力競(jìng)爭(zhēng)者，為開(kāi)發(fā)高效率抗氧化蛋白開(kāi)辟了新途徑。

4 總結(jié)與展望

SOD 是生物體內(nèi)一種重要的氧自由基清除劑，具有重要的生物學(xué)功能。許多疾病（如肌萎縮側(cè)索硬化、動(dòng)脈硬化閉塞癥、腫瘤轉(zhuǎn)移和感染性疾病等）的產(chǎn)生和發(fā)展與 SOD 缺乏或不正確折疊有關(guān)[57-60]。隨著 SOD 研究不斷深入和工業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模逐漸擴(kuò)大，SOD 還被應(yīng)用于化學(xué)、生物學(xué)、食品科學(xué)和植物病害預(yù)防等多個(gè)領(lǐng)域。但是受天然 SOD 的理化性質(zhì)所限，如靜脈注射后體內(nèi)半衰期僅為 6 min[9]，口服后在胃腸道中容易被破壞而失去療效，膜透過(guò)率低等，這些因素使其在應(yīng)用方面受到了很大的限制。目前，人們對(duì) SOD 蛋白進(jìn)行了化學(xué)修飾、人工有機(jī)合成 SOD 模擬物和運(yùn)用基因工程法制備 SOD 等方面的探索，普遍認(rèn)為通過(guò)基因工程制備重組人源 SOD 是最為經(jīng)濟(jì)、快捷、有效且安全的方法[16]。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的快速發(fā)展，國(guó)內(nèi)外在微生物發(fā)酵生產(chǎn)重組 SOD 的菌種選育、高產(chǎn)菌開(kāi)發(fā)和發(fā)酵工藝的優(yōu)化等方面都取得了一定進(jìn)展。通過(guò)基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組人源SOD，既降低了其他來(lái)源 SOD 的免疫原性問(wèn)題，又解決了人源 SOD 的來(lái)源問(wèn)題，并且可以克服傳統(tǒng)工藝限制，使人們可以按照自己的意愿定向改造目的蛋白。隨著研究的進(jìn)一步深入，基于基因工程主導(dǎo)的生物工程將逐漸推進(jìn)重組 SOD 實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，利用 SOD 開(kāi)發(fā)的產(chǎn)品也將會(huì)得到更為廣泛的應(yīng)用。

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楊金玲，Email：yangjl@imm.ac.cn，朱平，Email：zhuping@ imm.ac.cn

2019-04-22

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.04.011