張暢，胡阿錦，龔苗子，王躍，王淑芳，張雨，王云帆，繆琦，張晉夏

結(jié)直腸癌組織CD3免疫組織化學(xué)評(píng)分與腫瘤分化程度及預(yù)后關(guān)系分析

張暢，胡阿錦，龔苗子，王躍，王淑芳，張雨，王云帆，繆琦，張晉夏

100144 北京大學(xué)首鋼醫(yī)院病理科

分析結(jié)直腸癌組織 CD3 免疫組織化學(xué)評(píng)分與患者性別、年齡、腫瘤分化程度、TNM 分期、組織抗原表達(dá)及血清腫瘤抗原關(guān)系，評(píng)估 CD3 免疫組織化學(xué)評(píng)分在結(jié)直腸癌免疫狀態(tài)評(píng)估中的作用。

采用免疫組織化學(xué)方法對(duì) 116 例結(jié)直腸癌患者腫瘤標(biāo)本進(jìn)行 CD3 免疫組織化學(xué)染色并評(píng)分，將患者分成 CD3 低表達(dá)組與 CD3 高表達(dá)組。比較分析兩組患者的性別和年齡組成、腫瘤分化程度及 pTNM 分期。同時(shí)比較兩組腫瘤組織樣本 CEA、EGFR、MUC1、HER2、mesothelin、PD-1、PD-L1 及 FOXP3 免疫組織化學(xué)評(píng)分，并且比較兩組患者血清中 CEA、CA125 及 CA199 水平。

174 例組織標(biāo)本 CD3 免疫組織化學(xué)染色均可見陽性細(xì)胞，評(píng)分均在1 ~ 12 分之間。CD3 低表達(dá)組年齡

< 30 歲患者比例（9.20%）高于 CD3 高表達(dá)組（0%），> 65 歲患者比例（33.33%）低于高表達(dá)組（57.47%）。CD3 低表達(dá)組高分化癌（3.45%）及中分化癌（60.92%）比例低于 CD3 高表達(dá)組（分別為 9.20% 和 74.71%），而低分化癌（27.59%）及復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移癌（8.05%）比例高于 CD3 高表達(dá)組（分別為 9.20% 和 6.90%）。pTNM 分期越高預(yù)后越差，CD3 免疫組織化學(xué)評(píng)分越低（< 0.05）。CD3 低表達(dá)組患者組織樣本中 PD-1（< 0.001）、PD-L1（< 0.001）及 FOXP3（< 0.01）水平低于 CD3 高表達(dá)組，而兩組患者血清腫瘤標(biāo)志物（CEA、CA125 和 CA199）水平無明顯差異。

CD3 免疫組織化學(xué)評(píng)分可廣泛應(yīng)用于結(jié)直腸癌腫瘤組織，并反映患者的腫瘤相關(guān)免疫狀態(tài)與預(yù)后。

抗原，CD3； 預(yù)后； 抗原，腫瘤； 結(jié)直腸腫瘤； 腫瘤免疫

T 細(xì)胞是腫瘤免疫中重要的功能細(xì)胞，在腫瘤相關(guān)免疫過程中發(fā)揮重要作用。CD3 是T 細(xì)胞表面的特異性標(biāo)志物，CD3 免疫組織化學(xué)染色可很好地評(píng)估腫瘤組織中 T 細(xì)胞的浸潤水平。因此 CD3免疫組織化學(xué)染色常被用來評(píng)估患者的免疫狀態(tài)。本研究分析了腫瘤組織 CD3 免疫組織化學(xué)評(píng)分與患者性別和年齡分布、腫瘤組織分化程度、腫瘤組織抗原水平及血清腫瘤標(biāo)志物水平關(guān)系。希望通過分析評(píng)估 CD3 免疫組織化學(xué)評(píng)分對(duì)腫瘤免疫水平進(jìn)行評(píng)估。

本研究除對(duì)標(biāo)本進(jìn)行 CD3 免疫組織化學(xué)評(píng)分以外，還對(duì)標(biāo)本進(jìn)行了癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、間皮素（mesothelin）、黏蛋白 1（mucin 1，MUC1）、表皮生長因子受體 2（epidermal growth factor receptor 2，HER2）、程序性細(xì)胞死亡受體-1（programmed death 1，PD-1）、程序性死亡配體-1（programmed death-ligand 1，PD-L1）和叉狀頭型轉(zhuǎn)錄因子 3（forkhead box protein 3，F(xiàn)OXP3）的免疫組織化學(xué)評(píng)分。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床資料 納入 2017 年 5 – 12 月在我院經(jīng)組織病理學(xué)診斷確診的結(jié)直腸癌患者 174 例，男 103 例，女 71 例，年齡 24 ~ 93 歲，平均61 歲，所有患者均經(jīng)過手術(shù)治療，腫瘤完整切除后，對(duì)手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行病理分期、病理學(xué)診斷及免疫組織化學(xué)檢測。所有病例在手術(shù)前均未經(jīng)過放射治療或化學(xué)藥物治療。所有樣本中結(jié)直腸原發(fā)癌 156 例，復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移癌 18 例。

1.1.2 試劑與儀器 ZM-0061（CEA）、ZA-0579（mesothelin）、ZA-0505（EGFR）、ZM-0503（CD3）、ZM-0381（PD-1）抗體均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；ab134182（HER2）、ab228415（PD-L1）、ab99963（FOXP3）抗體購自美國 Abcam 公司。使用 Dako AutostainerLink 48 自動(dòng)染色儀一步法染色。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集與處理 新鮮手術(shù)切除標(biāo)本經(jīng) 10% 福爾馬林固定液固定 48 h 后，常規(guī)制作石蠟切片，HE 及免疫組織化學(xué)染色。

1.2.2 免疫組織化學(xué)評(píng)分 組織切片免疫組織化學(xué)評(píng)分= 著色強(qiáng)度分 × 陽性細(xì)胞著色比例分。著色強(qiáng)度分：不著色 0 分，弱著色 1 分，中著色2 分，強(qiáng)著色 3 分。陽性細(xì)胞比例分：0 ~ 5% 陽性 0 分，6% ~ 25% 陽性 1 分，26% ~ 50% 陽性2 分，51% ~ 74% 陽性 3 分，> 75% 陽性 4 分。

1.2.3 腫瘤病理分期 采用國際抗癌聯(lián)盟（UICC）惡性腫瘤 TNM 分期（第八版），結(jié)直腸惡性腫瘤病理分期（pTNM 分期）作為分期標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.4 血清腫瘤標(biāo)志物檢測 患者血清腫瘤標(biāo)志物檢測結(jié)果為患者病理學(xué)診斷確診后最近一次檢測結(jié)果，數(shù)據(jù)由本院電子病例系統(tǒng)提供。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

檢驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。GraphPad Prism 7.0 軟件（GraphPad 軟件公司）用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及統(tǒng)計(jì)圖表制作。

2 結(jié)果

2.1 CD3 免疫組織化學(xué)染色

174 例組織標(biāo)本 CD3 免疫組織化學(xué)染色均可見陽性細(xì)胞（圖 1），評(píng)分 1 ~ 12 分。根據(jù) CD3免疫組織化學(xué)評(píng)分將病例分為 CD3 低表達(dá)組（CD3 免疫組織化學(xué)染色評(píng)分≤ 6 分）與 CD3 高表達(dá)組（CD3 免疫組織化學(xué)染色評(píng)分 > 6 分）。CD3 低表達(dá)組患者 87 例，男 50 例（57.47%），女 37 例（42.53%）；CD3 高表達(dá)組患者87 例，男 54 例（62.07%），女 33 例（37.93%），兩組性別構(gòu)成比均無明顯差異。CD3 低表達(dá)組患者年齡 24 ~ 93 歲，平均 60.78 歲，< 30 歲8 例（9.20%），30 ~ 65 歲 50 例（57.47%），> 65 歲29 例（33.33%）；CD3 高表達(dá)組患者年齡32 ~86 歲，平均 63.40 歲，< 30 歲0 例，30 ~ 65 歲 50 例（57.47%），> 65 歲 37 例（42.53%）。兩組間不同年齡患者比例存在差異（< 0.05）（圖 2A）。比較不同年齡患者腫瘤組織 CD3 免疫組織化學(xué)評(píng)分，發(fā)現(xiàn)年齡 < 30 歲患者 CD3 免疫組織化學(xué)評(píng)分明顯偏低（< 0.01）（圖 2B）。

圖 1 CD3 免疫組織化學(xué)染色（A：CD3 免疫組織化學(xué)染色弱著色，著色強(qiáng)度分 1 分；B：CD3 免疫組織化學(xué)染色中著色，著色強(qiáng)度分 2 分；C：CD3 免疫組織化學(xué)染色強(qiáng)著色，著色強(qiáng)度分 3 分）

Figure 1 CD3 immunohistochemical staining (A: CD3 immunohistochemical staining weakly colored, with a color intensity score of 1; B: CD3 immunohistochemical staining for medium coloration with a color intensity score of 2; C: Strong staining of CD3 immunohistochemical staining with a color intensity score of 3)

病例數(shù)（例）Number of patients60 40 20 0CD3 低表達(dá)CD3 low expressionCD3 高表達(dá)CD3 high expressionCD3 免疫組織化學(xué)評(píng)分CD3 immunohistochemicalscores10 8 6 4 2 0 < 30 30 ~ 65 > 65 < 30 30 ~ 65 > 65 年齡AgeA 年齡AgeB

Figure 2 Sex, age and tumor tissue CD3 immunohistochemical scores in patients with different CD3 expression (A: CD3 low expression group and CD3 high expression group number of patients; B: CD3 immunohistochemical scores of tumor tissues of patients of different ages)

2.2 不同組織分化程度腫瘤組織 CD3 免疫組織化學(xué)評(píng)分

CD3 低表達(dá)組患者組織病理診斷為高分化癌者 3 例（3.45%），中分化 53 例（60.92%），低分化 24 例（27.59%），轉(zhuǎn)移/復(fù)發(fā) 7 例（8.05%）；CD3 高表達(dá)組患者高分化 8 例（9.20%），中分化 65 例（74.71%），低分化 8 例（9.20%），轉(zhuǎn)移/復(fù)發(fā) 6 例（6.90%）。兩組間不同腫瘤分化程度患者比例存在差異（< 0.05）（圖 3A）。將所有病例按組織分化程度分為高分化組、中分化組、低分化組及轉(zhuǎn)移/復(fù)發(fā)組，并比較各組 CD3 免疫組織化學(xué)染色評(píng)分。結(jié)果顯示，CD3免疫組織化學(xué)評(píng)分與腫瘤組織分化程度成正相關(guān)（< 0.05）（圖 3B）。

2.3 不同 pTNM 分期患者腫瘤組織 CD3 免疫組織化學(xué)評(píng)分

CD3 低表達(dá)組患者 pTNM 分期情況，I 期9 例（10.34%），II 期 34 例（39.08%），III 期27 例（31.03%），IV 期 17 例（19.54%）；CD3 高表達(dá)組 pTNM 分期情況，I 期 14 例（16.19%），II 期 42 例（48.28%），III 期 23 例（26.44%），IV 期 8 例（9.20%）。兩組間不同 pTNM 分期患者比例存在差異（< 0.05）（圖 4A）。比較不同 pTNM 分期患者腫瘤組織CD3 免疫組織化學(xué)染色評(píng)分。結(jié)果顯示，pTNM 分期越高預(yù)后越差，CD3 免疫組織化學(xué)評(píng)分越低（< 0.05）（圖 4B）。

病例數(shù)（例）Number of patients80 60 40 20 0CD3 低表達(dá)CD3 low expressionCD3 高表達(dá)CD3 high expressionCD3 免疫組織化學(xué)評(píng)分CD3 immunohistochemicalscores15 10 5 0 高分化High differentiation 中分化Medium differentiation 低分化Low differentiation 轉(zhuǎn)移/復(fù)發(fā)Metastasis/recurrence 高分化High differentiation 中分化Medium differentiation 低分化Low differentiation 轉(zhuǎn)移/復(fù)發(fā)Metastasis/recurrence 腫瘤組織分化程度Tumor tissue differentiationA 腫瘤組織分化程度Tumor tissue differentiationB

Figure 3 CD3 immunohistochemical scores of tumor tissues with different degrees of tissue differentiation (A: Number of different degrees of tissue differentiation in CD3 low-expression group and CD3 high-expression group; B: CD3 immunohistochemical scores of tumor tissues with different degrees of tissue differentiation)

病例數(shù)（例）Number of patients50 40 30 20 10 0CD3 低表達(dá)CD3 low expressionCD3 高表達(dá)CD3 high expressionCD3 免疫組織化學(xué)評(píng)分CD3 immunohistochemical scores10 8 6 4 2 0 I II III IV I II III IV pTNM 分期pTNM stagesA pTNM 分期pTNM stagesB

Figure 4 CD3 immunohistochemical scores of tumor tissues in patients with different pTNM stages (A: Number of different pTNM staging cases in the CD3 low expression group and the CD3 high expression group; B: Different pTNM staging cases CD3 immunohistochemical score of patient tumor tissue)

免疫組化評(píng)分Immunohistochemical scores14121088 6 4 2 0CD3 低表達(dá)CD3 low expressionCD3 高表達(dá)CD3 high expression PD1 PD-L1 FOXP3 Mesothelin HER2 MUC1 EGFR CEAA

Figure 5 Immunohistochemical staining scores of various antigens in tumor tissues (A) and serum tumor marker concentration in patients (B) with CD3 low expression and high expression (**< 0.01,***< 0.001)

2.4 不同 CD3 表達(dá)的腫瘤組織各種抗原免疫組織化學(xué)染色評(píng)分

CD3 低表達(dá)組 PD-1（< 0.001）、PD-L1（< 0.001）及 FOXP3（< 0.01）免疫組織化學(xué)評(píng)分低于 CD3 高表達(dá)組（圖 5A）。CD3 低表達(dá)及高表達(dá)組mesothelin、HER2、MUC1、EGFR 及 CEA 免疫組織化學(xué)評(píng)分無明顯差異。兩組患者血清腫瘤標(biāo)志物（CEA、CA125和 CA199）水平無明顯差異（圖 5B）。

3 討論

CD3 分子是成熟 T 細(xì)胞表面重要的分子標(biāo)志物，約 95% 成熟 T 細(xì)胞表面表達(dá) CD3 分子。CD3 分子與 T 細(xì)胞受體（TCR）一同構(gòu)成 TCR/CD3 復(fù)合物，在 T 細(xì)胞刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與 T 細(xì)胞活化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[1]。因此免疫組織化學(xué)染色檢測中 CD3 分子被認(rèn)為是 T 細(xì)胞的特異性標(biāo)記。研究中所有組織標(biāo)本 CD3 免疫組織化學(xué)染色均可見陽性細(xì)胞，說明在結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中普遍存在 T 淋巴細(xì)胞浸潤，因此 CD3 免疫組織化學(xué)評(píng)分在結(jié)直腸癌樣本中可廣泛應(yīng)用。

CD3 低表達(dá)組與高表達(dá)組性別構(gòu)成比例無明顯差異，可見腫瘤組織中 CD3 表達(dá)水平與性別無明顯相關(guān)性。兩組年齡構(gòu)成存在一定差異，其中 CD3 低表達(dá)組年齡較低患者（≤ 65 歲）比例低于高表達(dá)組。腫瘤組織 CD3 表達(dá)水平可能與患者免疫反應(yīng)水平正相關(guān)。腫瘤組織 CD3 低表達(dá)可能與患者 T 細(xì)胞功能不良、免疫監(jiān)視及免疫清除功能不全相關(guān)。免疫監(jiān)視及免疫清除功能不全導(dǎo)致患者發(fā)病年齡偏低。免疫功能較低同樣可能導(dǎo)致腫瘤分化程度較低，腫瘤惡性程度增高。

PD-1/PD-L1 及 FOXP3 均為 T 細(xì)胞功能抑制相關(guān)分子。腫瘤細(xì)胞表面表達(dá) PD-L1 與淋巴細(xì)胞表面 PD-1 分子結(jié)合，形成 PD-1/PD-L1 復(fù)合體，激活抑制性信號(hào)通路，抑制淋巴細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子分泌[2]。FOXP3 為叉狀頭轉(zhuǎn)錄因子家族成員，主要表達(dá)于 CD4+CD25+調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞（Treg），是其發(fā)育和功能的關(guān)鍵性分子。Treg 可抑制腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的功能及活性，是腫瘤免疫微環(huán)境中的免疫抑制性因素[3]。腫瘤免疫微環(huán)境中的免疫抑制性因素可以抑制 T 淋巴細(xì)胞的功能與活性，促進(jìn)腫瘤組織的惡化和增長，是腫瘤組織對(duì)機(jī)體免疫壓力的反擊性反應(yīng)[4]。CD3 高表達(dá)組 PD-1/PD-L1 及 FOXP3 水平較 CD3 低表達(dá)組增高，可能是腫瘤組織對(duì) T 細(xì)胞免疫作用的抑制性反應(yīng)。說明在免疫反應(yīng)較強(qiáng)的腫瘤組織局部，腫瘤組織對(duì)機(jī)體的免疫抑制反應(yīng)也會(huì)相應(yīng)增強(qiáng)。

總之，腫瘤組織 CD3 免疫組織化學(xué)評(píng)分可以反映機(jī)體的腫瘤免疫水平及預(yù)后情況，是良好的免疫評(píng)估手段。

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Analysis of relationship between CD3 immunohistochemical scores and tumor differentiation degrees and prognosis in colorectal cancer

ZHANG Chang, HU A-jin, GONG Miao-zi, WANG Yue, WANG Shu-fang, ZHANG Yu, WANG Yun-fan, MIAO Qi,ZHANG Jin-xia

Department of Pathology, Shougang Hospital, Peking University, Beijing 100144, China

The role of CD3 immunohistochemistry in the immune status assessment of colorectal cancer was evaluated by analyzing the relationship between CD3 immunohistochemistry scores and patients' gender, age, tumor differentiation degree, TNM stage, tissue antigen expression and serum tumor antigen levels.

CD3 immunohistochemical staining was performed on tumor specimens of 116 patients with colorectal cancer. The patients were then divided into groups with low CD3 expression and high CD3 expression according to CD3 immunohistochemistry scores. The gender and age composition, TNM stage and tumor differentiation degree of the two groups were compared and analyzed. Meanwhile, the immunohistochemical scores of CEA, EGFR, MUC1, HER2, mesothelin, PD-1, PD-L1 and FOXP3 in tumor tissue samples of the two groups were compared, and the serum levels of CEA, CA125 and CA199 were compared between the two groups.

All the 116 tissue specimens showed positive cells by immunohistochemical staining of CD3, and the scores were all between 1 and 12 points. The proportion of patients younger than 30 years old (9.20%) in the CD3 low-expression group was higher than that in the CD3 high-expression group (0%). However, the proportion of patients over 65 years old (33.33%) in the CD3 low-expression group was lower than that in the high-expression group (57.47%). The proportion of hyperdifferentiated cancer (3.45%) and medium-differentiated cancer (60.92%) in the CD3 low-expression group was lower than that in the CD3 high-expression group (9.20% and 74.71%, respectively), but the proportion of low-differentiated cancer (27.59%) and recurrent/metastatic cancer (8.05%) was higher than that in the CD3 high-expression group (9.20% and 6.90%, respectively). Patients with higher TNM stage had worse prognosis and lower CD3 immunohistochemical scores. The levels of PD-1 (< 0.001), PD-L1(< 0.001) and FOXP3 (< 0.01) in tissue samples of patients with low CD3 expression were lower than those of patients with high CD3 expression. There was no significant difference in serum tumor markers (CEA, CA125 and CA199) between the two groups.

CD3 immunohistochemistry scores can be widely used in tumor tissues of colorectal cancer and reflect the tumor-related immune status and prognosis of patients.

Antigens, CD3; Prognosis; Antigens, neoplasm; Colorectal neoplasm; Tumor-related immune

ZHANG Jin-xia, Email: kjfsa87@yeah.net

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.04.010

北京大學(xué)首鋼醫(yī)院臨床重點(diǎn)項(xiàng)目（1-138-2）

張晉夏，Email：kjfsa87@yeah.net

2019-03-22