周小劍，李玉華，唐湘，呂鈺冰，周嘉彬

烏頭堿抑制食管癌EC-1細胞增殖與侵襲并誘導其凋亡作用研究

周小劍，李玉華，唐湘，呂鈺冰，周嘉彬

511436 廣州市番禺區(qū)新造醫(yī)院檢驗科（周小劍、李玉華、唐湘）；511400 廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院檢驗科（呂鈺冰、周嘉彬）

研究烏頭堿對食管癌 EC-1 細胞增殖、侵襲和凋亡的影響。

CCK8 法及克隆形成抑制實驗檢測烏頭堿對食管癌 EC-1 細胞的生長抑制作用；采用 Hoechst 33258 染色檢測烏頭堿對 EC-1 細胞凋亡的影響；Transwell實驗觀察烏頭堿對細胞侵襲能力的作用；Western blot 檢測藥物作用后細胞侵襲及凋亡相關蛋白的表達情況。

CCK8 實驗結果顯示，烏頭堿可明顯抑制食管癌 EC-1 細胞增殖，并呈時間和劑量效應（< 0.01），48 h 對 EC-1 細胞半數(shù)抑制濃度（IC50）為 6.171 μg/ml。與正常對照組相比，6.25、12.5 μg/ml 的烏頭堿能明顯降低 EC-1 細胞克隆形成能力，抑制細胞侵襲以及誘導細胞凋亡，并且顯著下調(diào) MMP-9 及 Bcl-2 蛋白的表達。

烏頭堿具有明顯的抗腫瘤作用，其機制可能與其抑制腫瘤細胞增殖、侵襲及促凋亡相關。

烏頭堿； 食管腫瘤； 細胞增殖； 腫瘤侵潤； 細胞凋亡

食管癌（esophageal cancer）是常見的消化道惡性腫瘤，五年內(nèi)生存率在 10% 以下，手術切除后五年生存率也僅為 15% ~ 40%，嚴重威脅人類的生命健康[1]。由于缺乏特異的臨床表現(xiàn)，超過 80%的食管癌患者確診時已為中晚期，失去了手術治療的機會，放化療成為其主要治療方法[2]。然而，放化療常造成機體損傷，不良反應多，嚴重影響治療效果和患者的生活質(zhì)量[3]。隨著對傳統(tǒng)中藥研究的不斷深入，中藥治療腫瘤逐漸成為了熱點。研究發(fā)現(xiàn)，中藥治療在提高患者免疫力、增強化療敏感性、減輕不良反應以及延長生存期等方面發(fā)揮著重要作用[4-5]。

烏頭堿（aconitine）（圖 1）是存在于川烏、草烏、附子等植物中的主要有毒成分，也是發(fā)揮藥效的主要有效成分，性味辛、溫，臨床主要用于鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、消炎等，尤適用于消化系統(tǒng)癌痛，產(chǎn)生局部麻醉和鎮(zhèn)痛作用[6]。近年研究顯示，烏頭堿具有明顯的抗腫瘤作用，可抑制癌細胞增殖及促進凋亡[7-8]，但目前尚未發(fā)現(xiàn)烏頭堿與食管癌的相關報道。本研究旨在探索烏頭堿對食管癌EC-1 細胞的增殖、侵襲及凋亡等影響，為烏頭堿的抗癌機制研究提供思路。

圖 1 烏頭堿的結構

Figure 1 Structure of aconitine

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 細胞株 人食管癌 EC-1 細胞由中山大學附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤防治中心惠贈，用含 10%的胎牛血清、1% 鏈霉素（100 μg/ml）和青霉素（100 U/ml）的 DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

1.1.2 試劑 烏頭堿購自中國食品藥品檢定研究院，批號 112019-201601；DMEM 培養(yǎng)基、0.25% 胰酶、胎牛血清購自美國 Gibco 公司；CCK8試劑盒購自日本同仁公司；Transwell 小室及基質(zhì)膠均購自廣州藍吉生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱和 Bio-Tek 酶標儀 ELX-800 購自美國Biotech 公司；1300B2 生物安全柜購自美國 Thermo 公司；DMI4000 倒置熒光顯微鏡購自德國 Leica 公司；750D 照相機購自日本 Canon 公司。

1.2 方法

1.2.1 CCK8 檢測細胞增殖 取對數(shù)生長期的人食管癌 EC-1 細胞，0.25% 胰酶消化后制成細胞懸液，調(diào)整細胞密度至 5 × 104/ml，細胞懸液移至96 孔板，每孔 200 μl，預培養(yǎng) 24 h 待細胞貼壁良好。實驗設空白對照組（只含培養(yǎng)基，不含細胞）、陰性對照組（不加入藥物）及藥物處理組（烏頭堿濃度分別為 0.8、1.6、3.2、6.25、12.5、25.0 μg/ml），每組 6 個復孔，分別培養(yǎng) 24、48、72 h。吸棄舊培養(yǎng)液，每孔加入新鮮培養(yǎng)基 100 μl 和CCK8 反應液10 μl，孵育 4 h，酶標儀測定各組在450 nm 處吸光度值（）。抑制率 =[（陰性對照組–藥物處理組）/（陰性對照組–空白對照組）]× 100%，計算抑制率及半數(shù)抑制率（IC50）。

1.2.2 克隆形成實驗 6 孔培養(yǎng)板接種 1200 個處于對數(shù)生長期的人食管癌EC-1 細胞。37 ℃、5% CO2孵育 24 h 后，加入適當濃度的烏頭堿與培養(yǎng)基混合液，待藥物作用 EC-1 細胞 7 d 后。棄去上清液，1 × PBS 溶液浸洗 2 次，加入 4% 多聚甲醛固定 15 min，棄固定液，加入結晶紫染液染色 15 min，洗去染液，空氣中干燥，照相。隨后加入 10% 冰醋酸溶液 2 ml，靜置 30 min，待結晶紫溶解后，取 100 μl 加入 96 孔板中，酶標儀讀取各孔 560 nm 波長處值并計算克隆抑制率?？寺∫种坡剩?）=（對照組–加藥組）/對照組× 100%。

1.2.3 Transwell 小室檢測細胞侵襲能力 Transwell 小室上室用 100 μl Matrigel 膠包被，在紫外線下照射 2 h。EC-1 細胞分別進行適當濃度的烏頭堿處理 48 h 后，0.25% 胰酶消化成細胞懸液，上室進行鋪膠，加入 200 μl 含約 5 × 104個細胞的無血清DMEM 培養(yǎng)液，下室加入含 10% 胎牛血清的 DMEM，24 h 后棄去上室培養(yǎng)基，拭去上室內(nèi)的 Matrigel 膠和細胞，加入 4% 多聚甲醛固定 10 min，1 × PBS 漂洗 2 次，加入 0.1% 結晶紫染色 10 min，晾干，倒置顯微鏡觀察，隨機選取 3 個視野于高倍鏡下計數(shù)。

1.2.4 Hoechst 33258 法檢測細胞凋亡 取 1 × 106個細胞接種于 6 孔板，制備細胞爬片，24 h 后用適當濃度的烏頭堿分別作用于食管鱗癌 EC-1 細胞 48 h，進行 Hoechst 染色。激發(fā)波長 350 nm左右，發(fā)射波長 460 nm 左右，于倒置熒光顯微鏡高倍鏡下觀察。在不同視野下計數(shù) 200 個細胞，計算細胞凋亡率。

1.2.5 Western blot 檢測 MMP-9、Bcl-2 蛋白的表達 將 EC-1 細胞（1 × 106個/孔）置于 6 孔板中，待 24 h 細胞貼壁后加入適當濃度烏頭堿孵育 48 h，收集細胞 PBS 洗滌 2 次，加入細胞裂解液冰上放置 30 min，1200 r/min、4 ℃離心2 min，取上清，BCA 法蛋白定量。調(diào)整蛋白濃度40 μg/孔進行 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉移至醋酸纖維膜上，5% 脫脂牛奶封閉后分別加入MMP-9（1:1000）、Bcl-2（1:1000）、β-actin（1:5000）一抗，4 ℃孵育過夜，TBST 漂洗 3 次后加入相應 HRP 標記二抗（1:3000），37 ℃孵育 1 h，TBST 漂洗 3 次后 ECL 顯色劑顯色并于凝膠成像系統(tǒng)掃描成像。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 CCK8 法檢測細胞增殖能力

不同濃度烏頭堿分別干預 EC-1 細胞 24、48 和 72 h 后，CCK8 實驗檢測細胞增殖抑制能力。如圖 2 所示，EC-1 細胞增殖抑制率隨著烏頭堿濃度及作用時間的增加而增加，呈現(xiàn)明顯的劑量、時間-效應關系，其 IC50分別為10.68、6.171 和4.104 μg/ml。根據(jù)各組抑制率結果，烏頭堿作用 48、72 h 抑制率相差作用明顯，為保證一定的細胞存活數(shù)量以及蛋白質(zhì)提取量，故選取作用時間為 48 h，作用濃度為 6.25、12.5 μg/ml 的烏頭堿進行后續(xù)實驗。

細胞抑制率（%）Cell inhibition rate (%)1009080706050403020100 0.8 1.6 3.2 6.25 12.5 25.0 烏頭堿濃度（μg/ml）Concentration of aconitine (μg/ml)

Figure 2 The proliferation inhibition rate of EC-1 cells was detected by CCK8

2.2 細胞克隆形成能力檢測

從圖 3A 可見，0、6.25、12.5 μg/ml濃度烏頭堿作用于 EC-1 細胞 7 d后，各組的克隆形成數(shù)隨藥物濃度增加而減少，藥物濃度越高，克隆能力降低越明顯。溶解結晶紫后于酶標儀讀取各孔 560 nm吸光度（圖3B），各組間吸光度差異有統(tǒng)計學意義（= 127.59，= 0.00）。代入公式計算得 6.25 和12.5 μg/ml 的烏頭堿對 EC-1 細胞的克隆抑制率分別為（32.17 ± 1.05）% 和（44.35 ± 0.97）%。

2.3 Transwell 實驗檢測細胞侵襲能力

0、6.25、12.5 μg/ml 的烏頭堿處理 48 h 后，在顯微鏡（× 200）下每孔隨機選擇 3 個視野計數(shù)細胞數(shù)，三組細胞的平均穿膜細胞數(shù)分別為每視野271.5 ± 12.7、165.6 ± 8.2 和 122.4 ± 5.8，各組間差異有統(tǒng)計學意義（= 204.34，= 0.00），提示烏頭堿能抑制 EC-1 細胞的侵襲能力（圖 4A）。

2.4 細胞凋亡檢測

Hoechst 33258 染色法觀察 0、6.25、12.5 μg/ml 濃度的烏頭堿處理 EC-1 細胞 48 h 后細胞形態(tài)學的改變。倒置熒光顯微鏡下可見凋亡細胞胞核呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染，顏色發(fā)白（圖 4B）。鏡下計數(shù)凋亡細胞數(shù)，對照組的凋亡指數(shù)為（4.54 ± 0.57）%，6.25、12.5 μg/ml 的烏頭堿作用 EC-1 細胞后凋亡指數(shù)分別為（29.43 ± 1.57）% 和（64.33 ± 3.89）%，差異有統(tǒng)計學意義（= 428.56，= 0.00）。

2.5 Western blot 檢測 MMP-9、Bcl-2 蛋白表達

不同濃度烏頭堿作用 EC-1 細胞 48 h 后，Western blot 檢測得侵襲相關蛋白 MMP-9 蛋白的表達下調(diào)（0.51 ± 0.02、0.34 ± 0.01、0.18 ± 0.01），凋亡相關蛋白 Bcl-2 蛋白的表達量也減少（0.86 ± 0.04、0.67 ± 0.02、0.23 ± 0.02），且呈劑量依賴性（< 0.01）（圖 4C）。

3 討論

中藥在增強機體免疫力和促進腫瘤細胞凋亡等方面具有獨特的療效，多種中藥成分能有效發(fā)揮抗腫瘤作用[9-10]，且其副作用低，逐漸引起眾多研究者的關注?，F(xiàn)代藥理研究表明，烏頭類中藥如烏頭、附子等具有回陽救逆、祛風除濕、溫經(jīng)止痛的功效，主要用于治療跌打損傷、風濕、關節(jié)炎、中風癱瘓、神經(jīng)性疼痛、胃腸炎、癰疽瘡毒等癥[11-12]。烏頭堿作為多效性天然活性物質(zhì)，在強心、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等方面已顯示了良好的療效[6]。以往，對烏頭堿的研究主要集中于對心肌細胞及心血管系統(tǒng)方面，與腫瘤相關研究報道較少。隨著對烏頭堿的研究不斷深入，研究者逐漸發(fā)現(xiàn)烏頭堿的抗癌價值。

0 6.25 12.5烏頭堿（μg/ml）Aconitine (μg/ml) A5602.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 0 6.25 12.5 A 烏頭堿濃度（μg/ml）Concentration of aconitine(μg/ml)B

Figure 3 Inhibition of different concentrations of aconitine on the ability of EC-1 cells to clone and form esophageal cancer (A: Platelet assay was used to detect cell clonal ability; B: Quantitative detection of cell clonal ability by spectrophotometry;*Compared with the control group,< 0.01)

0 6.25 12.5 烏頭堿（μg/ml）Aconitine (μg/ml)A

Figure 4 Effects of aconitine on the invasion and apoptosis of EC-1 cells in esophageal cancer [A: Transwell assay was used to detect changes in the invasion ability of aconitine on EC-1 cells (× 200); B: Apoptosis of EC-1 cells after treatment with aconitine was detected by Hoechst 33258 (× 200 ); C: Western blot was used to detect the effects of aconitine on MMP-9 and Bcl-2 proteins in EC-1 cells]

研究顯示，烏頭堿能抑制大分子 DNA、RNA 的合成，抑制腫瘤細胞增殖，通過促進腫瘤細胞凋亡及誘導腫瘤細胞分化等多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。Ji 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度烏頭堿對胰腺癌細胞的生長抑制率呈時間和劑量依賴性，并可通過NF-κB 信號通路誘導人胰腺癌細胞的凋亡。烏頭堿也可通過抑制 PI3K/AKT 和 MAPK/ERK1/2 信號通路影響 PCNA mRNA 及其蛋白的表達，從而在體內(nèi)、外抑制黑色素瘤的增殖及促進癌細胞凋亡[8]。Pyaskovskaya 等[14]報道，烏頭堿成分能增強二氯乙酸對 Ehrlich 癌細胞的殺傷作用。

本研究以食管癌為研究對象，利用 CCK8 法檢測細胞活性，發(fā)現(xiàn)不同濃度的烏頭堿對食管癌 EC-1 細胞有明顯的生長抑制作用，并呈時間-濃度依賴關系；EC-1 細胞的克隆形成能力也隨烏頭堿的濃度增加而遞減，證實了烏頭堿能有效抑制 EC-1細胞的生長作用。浸潤轉移是晚期食管癌的重要死因，因此降低腫瘤細胞的侵襲能力尤為關鍵。烏頭堿能顯著抑制 EC-1 細胞的侵襲，并隨烏頭堿濃度的增加，抑制能力越強。據(jù)報道，在侵襲過程中細胞外基質(zhì)降解或是長出基膜是造成腫瘤浸潤轉移的主要原因，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是基質(zhì)降解過程中最為關鍵的蛋白水解酶。對 MMPs 的研究始于 1962 年，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了 28 種人源性MMPs，它們屬于依賴鋅的內(nèi)生肽酶家族，其中包括 MMP-9[15]。當前，臨床研究中發(fā)現(xiàn)，在胃癌、肺癌、乳腺癌等疾病中，MMP-9 的表達水平最高，這主要是和腫瘤的侵襲轉移有關系[16]。本研究中，6.25、12.5 μg/ml 烏頭堿與對照組相比能明顯抑制 MMP-9 的表達，提示烏頭堿通過下調(diào) EC-1 細胞侵襲能力從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

細胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞自主的有序性死亡，又稱 I 型程序性細胞死亡。細胞凋亡與腫瘤發(fā)生與發(fā)展密切相關，誘導細胞凋亡可能是抑制腫瘤生長的機制之一。本研究運用 Hoechst 33258 染色法證實了烏頭堿對 EC-1 細胞的誘導凋亡作用，且有濃度依賴性，提示了烏頭堿抑制 EC-1 細胞生長與細胞凋亡相關，其機制可能與降低了凋亡相關蛋白 Bcl-2 的影響有關，但具體機制有待進一步實驗探討。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)烏頭堿能抑制食管癌 EC-1 細胞增殖，克隆形成能力、侵襲能力亦呈劑量依賴性降低，并能誘導細胞凋亡的發(fā)生。我們將進一步探討烏頭堿的抗癌機制，為食管癌的臨床治療提供新的思路和依據(jù)。

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Aconitine inhibits the proliferation and invasion while induces the apoptosis of esophageal cancer EC-1 cells

ZHOU Xiao-jian, LI Yu-hua, TANG Xiang, LYU Yu-bing, ZHOU Jia-bin

Department of Clinical Laboratory, Xinzao Hospital, Guangzhou 511436, China (ZHOU Xiao-jian, LI Yu-hua, TANG Xiang); Department of Clinical Laboratory, Panyu Center Hospital, Guangzhou 511400, China (LYU Yu-bing, ZHOU Jia-bin)

To investigate the effects of aconitine on the proliferation, invasion and apoptosis of esophageal cancer cells EC-1.

CCK8 assay and colony formation experiment were used to check the inhibitory effect of aconitine on EC-1 esophageal cancer cell growth. Effect of aconitine on apoptosis in EC-1 cells was detected by Hoechst 33258 staining assay. Transwell method was used to valuate the ability of cell invasion after aconitine treatment. Western blot was used to detect the expression of proteins related to cell invasion and apoptosis after treatment.

Aconitine significantly inhibited the proliferation of esophageal cancer cell line EC-1 in both time- and dose-dependent manner (< 0.01). The half inhibitory concentration of 48 h on EC-1 cells was 6.171 μg/ml. When compared with the normal control group, 6.25 and 12.5 μg/ml aconitine treatment could significantly reduce the colony formation and cell invasion, while induce apoptosis in the cells, and aconitine also significantly reduce the expression of MMP-9 and Bcl-2.

Aconitine has significant antitumor effect, which may be correlated with the inhibition of tumor cell proliferation and invasion as well as the induction of apoptosis.

Aconitine; Esophageal neoplasms; Cell proliferation; Neoplasm invasiveness; Apoptosis

ZHOU Xiao-jian, Email: lwtgzq@yeah.net

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.04.008

周小劍，Email：lwtgzq@yeah.net

2019-03-29