倪俊聲，鄭浩，黃智平，陶元平，周偉平

miR-1910-3p在肝細(xì)胞癌中通過靶向β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶3發(fā)揮腫瘤抑制作用

倪俊聲*，鄭浩*，黃智平，陶元平，周偉平

200433 上海，海軍軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院肝外三科（倪俊聲、鄭浩、陶元平、周偉平）；510010 廣東，廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院肝膽外科（黃智平）

研究miR-1910-3p 在肝細(xì)胞癌（HCC）中的表達(dá)和功能。

qRT-PCR 檢測在 68 個 HCC 組織中 miR-1910-3p 的表達(dá)情況。MTT 試驗確定 miR-1910-3p 在 HCC 進(jìn)展中的生物學(xué)作用。采用生物信息學(xué)分析、Western blot 和雙熒光素酶報告試驗確定 miR-1910-3p 抑制 HCC 細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。

miR-1910-3p 在 HCC 中表達(dá)下調(diào)。統(tǒng)計學(xué)分析顯示，miR-1910-3p 的低表達(dá)與腫瘤大?。? 0.031）、靜脈浸潤（= 0.014）、TNM 分期（= 0.048）顯著相關(guān)。此外，miR-1910-3p 低表達(dá)的 HCC 患者總體生存率和無瘤生存率均較差（= 0.003，= 0.041）。MTT 試驗顯示，miR-1910-3p 抑制 HCC 細(xì)胞增殖。生物信息學(xué)工具、熒光素酶報告試驗、qRT-PCR、Western blot 等檢測結(jié)果表明 β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶 3（B4GALT3）是 HCC 細(xì)胞中 miR-1910-3p 的下游靶點。

miR-1910-3p 通過直接靶向 B4GALT3 抑制 HCC 細(xì)胞的增殖。

癌，肝細(xì)胞； β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶 3； miR-1910-3p

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的原發(fā)性肝癌，具有較高的發(fā)病率和死亡率[1-2]。肝細(xì)胞癌通常發(fā)生在有乙型、丙型肝炎合并肝硬化或有肝癌家族史的人群[3-4]。目前，肝細(xì)胞癌的病因和確切的分子機(jī)制尚不完全清楚[5–6]。因此，迫切需要進(jìn)一步研究肝細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制和尋找有效的 HCC 治療策略。

microRNAs（miRNAs）是一類無編碼蛋白能力的非編碼RNAs[7-8]。研究報道證實，多種 miRNAs 在 HCC 的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用[9]。例如，miR-23b 作為一種致癌基因，通過靶向 ST7L 促進(jìn) HCC 的進(jìn)展[10]；miR-370 通過下調(diào) PIM1 表達(dá)抑制 HCC 的發(fā)生和發(fā)展[11]。然而，miR-1910-3p 在 HCC 中確切的表達(dá)和功能尚不清楚。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織樣本 68 例經(jīng)組織病理證實的 HCC 組織樣本和對應(yīng)癌旁非腫瘤組織樣本來自于 2010 年 6 月 – 2012 年 12 月間在海軍軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院接受手術(shù)治療的 HCC 患者。所有患者術(shù)前均未接受化療或放療。所有的樣本均儲存于–80 ℃。本研究得到了海軍軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)且所有患者簽署知情同意書。

1.1.2 細(xì)胞 人正常肝細(xì)胞系 LO2 和 5 株 HCC 細(xì)胞系 HepG2、Hep3B、Huh7、SMMC-7721、MHCC-97H 購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。所有細(xì)胞都孵育在含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基中，于 37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.1.3 主要儀器和試劑 胎牛血清購自美國 Gibco 公司；DMEM 培養(yǎng)基和lipofectamine2000 購自美國 Invitrogen 公司；miR-1910-3p 抑制劑、miR-1910-3p 模擬物、β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶 3（B4GALT3）克隆、B4GALT3 siRNA 和報告基因均購自上海吉馬生物制藥有限公司；一抗B4GALT3和GAPDH 購自美國Abcam 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前將細(xì)胞種植于培養(yǎng)板中。當(dāng)細(xì)胞密度接近 70% 時，將 miR-1910-3p抑制劑、miR-1910-3p 模擬物、B4GALT3 克隆、B4GALT3 siRNAs 和 Lipofectamine2000 相應(yīng)的對照物進(jìn)行轉(zhuǎn)染。根據(jù)產(chǎn)品說明書進(jìn)行所有實驗的操作。

1.2.2 qRT-PCR 檢測 具體實驗操作過程依照參考文獻(xiàn)[12]，U6 和 GAPDH 分別為 miR-1910-3p 和 B4GALT3 內(nèi)參基因。用 2-??CT法分析 miR-1910-3p 和 B4GALT3 的相對表達(dá)情況。

引物序列如下：miR-1910-3p 上游5' TCCGCT TGTTCGGACCGTG 3'，miR-1910-3p 下游5' AAC AATACCGCCTAGGGC 3'；U6 上游5' CTCGCTTC GGCAGCACA 3'，U6 下游5' ACGCTTCACGAAT TTGCGT 3'；B4GALT3 上游5' CGAGATCAGGGA CCGACATTT 3'，B4GALT3 下游5' GATCGTTCT GGACAGTAGGGC 3'；GAPDH 上游5' AGCCAC ATCGCTCAGACAC 3'，GAPDH 下游5' GCCCAA TACGACCAAATCC 3'。

1.2.3 MTT 試驗 具體實驗操作過程依照參考文獻(xiàn)[12]。

1.2.4 熒光素酶報告基因試驗 具體實驗操作過程依照參考文獻(xiàn)[12]和試劑說明書進(jìn)行。

1.2.5 Western blot 具體實驗操作過程依照參考文獻(xiàn)[12]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

miR-1910-3p相對表達(dá)量Relative miR-1910-3pexpression15 10 5 0 HCC01HCC02HCC03HCC04HCC05HCC06HCC07HCC08HCC09HCC10HCC11HCC12HCC13HCC14HCC15HCC16HCC17HCC18HCC19HCC20HCC21HCC22HCC23HCC24HCC25HCC26HCC27HCC28HCC29HCC30HCC31HCC32HCC33HCC34

Figure 1 miR-1910-3p is down-regulated in HCC tissues [A: qRT-PCR was conducted to explore the expression of miR-1910-3p in HCC tissues (n = 68) and adjacent non-tumor tissues (n = 68); B: Overall survival; C: Disease-free survival]

2 結(jié)果

2.1 在 HCC 組織中 miR-1910-3p 表達(dá)下調(diào)

qRT-PCR 數(shù)據(jù)顯示，與對應(yīng)的癌旁非腫瘤組織相比，miR-1910-3p 在 HCC 腫瘤中明顯表達(dá)下調(diào)（圖 1A）。表明在 HCC 中，miR-1910-3p 表達(dá)下調(diào)且可能作為 HCC 的腫瘤抑制因子。

2.2 miR-1910-3p 表達(dá)下調(diào)在 HCC 中的臨床意義

為了探討 miR-1910-3p 表達(dá)下調(diào)在 HCC 中的臨床意義，基于 miR-1910-3p 在 HCC 組織中的中位表達(dá)量，我們將 68 例患者分為兩組（低表達(dá)組 n = 33，高表達(dá)組 n = 35）。如表 1 所示，卡方檢驗結(jié)果表明，miR-1910-3p 低表達(dá)與腫瘤大?。? 0.031）、靜脈浸潤（= 0.014）、TNM 分期（= 0.048）顯著相關(guān)。此外，低表達(dá)的 miR-1910-3p患者的總體生存率（= 0.003，圖 1B）和無瘤生存率（= 0.041，圖 1C）均較差。因此，我們認(rèn)為 miR-1910-3p 是一種很有潛力的 HCC 診斷和預(yù)后的指標(biāo)。

2.3 miR-1910-3p 抑制 HCC 細(xì)胞增殖

為了探討 miR-1910-3p 對 HCC 細(xì)胞增殖的影響，首先檢測了 miR-1910-3p 在HCC 細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示 miR-1910-3p 在 HCC 細(xì)胞系中的表達(dá)明顯低于人正常肝細(xì)胞 LO2（圖 2A）。隨后，將 miR-1910-3p 抑制劑和模擬物分別轉(zhuǎn)染至 Hep3B 和 MHCC-97H 細(xì)胞中并且通過 qRT-PCR 驗證轉(zhuǎn)染效率，MHCC-97H-miR-1910-3p 細(xì)胞中miR-1910-3p 表達(dá)顯著升高（圖2B），而Hep3B-anti-miR-1910-3p 細(xì)胞中miR-1910-3p 表達(dá)顯著降低（圖2C）。

MTT 試驗結(jié)果表明過表達(dá) miR-1910-3p 可以抑制 MHCC-97H 細(xì)胞的增殖能力（圖 2D）。另一方面，降低 miR-1910-3p 表達(dá)可促進(jìn) Hep3B 細(xì)胞的增殖能力（圖 2E）。以上結(jié)果提示 miR-1910-3p 可抑制 HCC 細(xì)胞的增殖能力。

2.4 B4GALT3 是 miR-1910-3p 的下游靶點

為了探討 miR-1910-3p 抑制 HCC 細(xì)胞增殖的潛在分子學(xué)機(jī)制，利用在線軟件 TargetScan 7.2 預(yù)測 miR-1910-3p 的潛在結(jié)合靶點，提示 miR-1910-3p 可與 B4GALT3 的 3'-UTR 結(jié)合（圖 3A）。過表達(dá) miR-1910-3p 降低了 MHCC-97H 細(xì)胞系中的 B4GALT3-wt-3'-UTR 的熒光活力，而對 B4GALT3-mut-3'-UTR 沒有任何影響（圖 3B）。此外，Western blot 和 qRT-PCR 結(jié)果顯示過表達(dá) miR-1910-3p 降低了 MHCC-97H 中 B4GALT3蛋白和 mRNA 的表達(dá)；而 miR-1910-3p 抑制劑可以增加 Hep3B 中 B4GALT3 蛋白和 mRNA 的表達(dá)（圖 3C 和 3D）。隨后，我們檢測了 miR-1910-3p 高、低表達(dá)的 HCC 組織中 B4GALT3 的 mRNA 表達(dá)。qRT-PCR 數(shù)據(jù)提示在 miR-1910-3p 高表達(dá)的 HCC 組織中，B4GALT3 表達(dá)顯著降低（圖 3E）。以上結(jié)果提示，在 HCC 中 miR-1910-3p 可靶向 B4GALT3 的 3'-UTR 抑制其表達(dá)。

表 1 68 例 HCC 患者的 miR-1910-3p 表達(dá)與臨床病理因素相關(guān)

miR-1910-3p的相對表達(dá)量Relative miR-1910-3pexpression1.5 1.0 0.5 0 LO2 Hep3B HepG2 Huh7 SMMC-7721 MHCC-97HA

Figure 2 miR-1910-3p suppresses proliferation of HCC cells (A: qRT-PCR revealed that the expression of miR-1910-3p was notably decreased in HCC cell lines; B: miR-1910-3p mimics significantly increased the expression of miR-1910-3p in MHCC-97H cells; C: miR-1910-3p inhibitors significantly decreased the expression of miR-1910-3p in Hep3B cells; D: MTT assay indicated that miR-1910-3p mimics notably suppressed viability of MHCC-97H cells; E: MTT assay indicated that miR-1910-3p inhibitors markedly enhanced viability of Hep3B cells;*< 0.05,***< 0.001)

3 討論

miRNAs 的異常表達(dá)與 HCC 的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[8-9]，并可作為 HCC 診斷、預(yù)后和治療靶點的潛在和有價值的生物標(biāo)志物和預(yù)后指標(biāo)[9]。本研究中，發(fā)現(xiàn) miR-1910-3p 在 HCC 組織和細(xì)胞系中均明顯下調(diào)表達(dá)。隨后，探討 miR-1910-3p 在 HCC 中的臨床意義。首先，分析了 miR-1910-3p 與臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果顯示 miR-1910-3p 低表達(dá)與腫瘤大小、靜脈浸潤、TNM 分期顯著相關(guān)。接下來，探討了 miR-1910-3p 對 HCC 患者預(yù)后的影響，發(fā)現(xiàn) miR-1910-3p 低表達(dá)的 HCC 患者總體生存率和無瘤生存率較差。這些結(jié)果表明 miR-1910-3p 在 HCC 中是一種有價值的腫瘤標(biāo)志物且可能在 HCC 發(fā)展中起到抑癌作用。功能試驗結(jié)果表明過表達(dá) miR-1910-3p 可抑制 HCC 細(xì)胞增殖能力，而下調(diào) miR-1910-3p 的表達(dá)則相反。由此，我們認(rèn)為 miR-1910-3p 在 HCC 中具有腫瘤抑制作用。

A相對熒光素酶活性（%）Relative Luciferase activity (%)150 100 50 0 MHCC-97H Hep3B B4GALT3 GAPDH miR-NC miR-1910-3p miR-NC miR-1910-3p miR-NC miR-1910-3p miR-NC anti-miR-1910-3pC Wt MutB

Figure 3 B4GALT3 is a downstream target of miR-1910-3p in HCC cells [A: Results from bioinformatics tools (TargetScan 7.2) revealed that 3′-UTR of B4GALT3 had the bind site for miR-1910-3p; B: Luciferase reporter assay revealed that miR-1910-3p mimics repressed the fluorescence activity of B4GALT3-wt-3′UTR, while miR-1910-3p inhibitors enhanced the fluorescence activity of B4GALT3-wt-3′UTR. The alteration of miR-1910-3p expression had no effect on B4GALT3-mut-3′UTR; Western blot (C) and qRT-PCR (D) revealed that the expression of B4GALT3 protein and mRNA in MHCC-97H was significantly decreased by miR-1910-3p mimics, while miR-1910-3p inhibitors notably increased B4GALT3 expression in Hep3B cells; E: The expression of B4GALT3 mRNA was significantly lower in high miR-1910-3p HCC tissues;*< 0.05,**< 0.01,***< 0.001]

有研究報道稱 miRNAs 可通過抑制轉(zhuǎn)錄或促進(jìn)靶點 mRNAs 的降解來影響腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展[10-11]。利用在線軟件（http://www.targetscan.org/ vert_72/），我們重點關(guān)注了在 HCC 進(jìn)展中發(fā)揮重要調(diào)控作用的 B4GALT3 蛋白[13]。B4GALT 家族由 B4GAL1 ~ 7 組成，在糖基化中發(fā)揮著重要作用。異常糖基化已被證實與細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)化、分化、黏附、轉(zhuǎn)移和腫瘤免疫監(jiān)測在內(nèi)的多種致癌特性相關(guān)[14]。B4GALTs 的作用主要是將半乳糖從尿苷二磷酸半乳糖轉(zhuǎn)移到 N-乙酰氨基葡萄糖以形成重聚-N-乙酰氨基乳糖。據(jù)報道，重聚-N-乙酰氨基乳糖鏈主要由 N-多糖、O-多糖、糖脂、糖胺聚糖鏈組成。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn) B4GALT3 是miR-1910-3p 直接作用靶點，這些結(jié)果為 B4GALT3在 HCC 發(fā)生和進(jìn)展的分子學(xué)機(jī)制研究提供了新的思路。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn) HCC 中 miR-1910-3p 異常低表達(dá)并且與腫瘤大小、靜脈浸潤、TNM 分期和預(yù)后差密切相關(guān)。功能上，miR-1910-3p 通過抑制 HCC 細(xì)胞的增殖而發(fā)揮抗癌的作用。機(jī)制上，B4GALT3 是 HCC 細(xì)胞中 miR-1910-3p 新的作用靶點?？傊?，miR-1910-3p 可能是一個新的潛在的 HCC 腫瘤標(biāo)志物、預(yù)后指標(biāo)和治療靶點。

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miR-1910-3p functions as a tumor suppressor via targeting beta-1,4-galactosyltransferase 3 in hepatocellular carcinoma

NI Jun-sheng, ZHENG Hao, HUANG Zhi-ping, TAO Yuan-ping, ZHOU Wei-ping

Third Department of Hepatic Surgery, Third Affiliated Hospital, Naval Military Medical University, Shanghai 200433, China (NI Jun-sheng, ZHENG Hao, TAO Yuan-ping, ZHOU Wei-ping); Department of Hepatobiliary Surgery, General Hospital of Guangzhou Military Command of PLA, Guangdong 510010, China (HUANG Zhi-ping)

Previous studies revealed that microRNAs (miRNAs) play a critical role in the occurrence and progression of hepatocellular carcinoma (HCC). However, the exact expression and functions of miR-1910-3p in HCC are still uncovered.

miR-1910-3p was validated in an independent validation sample cohort of 68 HCC tissues. Functional assays and MTT assay were used to determine the oppressor role of miR-1910-3p in human HCC progression. Furthermore, bioinformatics analysis, Western blot and dual-luciferase reporter assay were used to determine the mechanism by which miR-1910-3p suppresses the proliferation of HCC cells.

Here, we reported that miR-1910-3p was downregulated in HCC. Clinically, statistical analysis showed that miR-1910-3p expression was significantly associated with tumor size (= 0.031), venous infiltration (=0.014), and TNM stage (=0.048). In addition, HCC patients with lower miR-1910-3p expression had worse overall survival and disease-free survival (= 0.003,= 0.041). Functionally, MTT assay revealed that miR-1910-3p inhibited the proliferation of HCC cells. Furthermore, bioinformatics tools, luciferase reporter assay, real-time PCR, and Western blot showed that B4GALT3 was a downstream target of miR-1910-3p in HCC cells. In addition, rescue experiments indicated that B4GALT3 mediated the effects of miR-1910-3p on the proliferation of HCC cells.

We conclude that miR-1910-3p suppresses the proliferation of HCC cells via directly targeting B4GALT3. miR-1910-3p may be a potential prognosis indicator and therapeutic target for HCC.

Carcinoma, hepatocellular; beta-1,4-galactosyltransferase 3; miR-1910-3p

ZHOU Wei-ping, Email: ehphwp@163.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.04.006

國家自然科學(xué)基金面上項目（81471038）；上海市衛(wèi)生和計劃生育委員會科研課題青年項目（20154Y0083）；上海市衛(wèi)計委青年基金（20164Y0189）；國家自然科學(xué)基金創(chuàng)新研究群體（81521091）

周偉平，Email：ehphwp@163.com

2018-12-18

*同為第一作者