呂廣新，史北辰，樊帥，楊兆勇，張志斐，陳靜

人類線粒體肌酸激酶的固定化及酶學(xué)性質(zhì)研究

呂廣新*，史北辰*，樊帥，楊兆勇，張志斐，陳靜

063210 唐山，華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（呂廣新、陳靜），藥學(xué)院（史北辰、張志斐）；100050 北京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所微生物代謝工程室（樊帥、楊兆勇）

人源肌酸激酶 uMtCK 具有良好的催化肌酸生成磷酸肌酸的活性，開發(fā)固定化uMtCK 酶法生成磷酸肌酸，實(shí)現(xiàn)其工業(yè)化應(yīng)用價(jià)值。

將異源表達(dá)的 uMtCK 固定在納米磁性材料 Fe3O4@Histidine-Ni 上，制備固定化酶Fe3O4@Histidine- Ni/uMtCK，并進(jìn)行催化反應(yīng)。與游離酶 uMtCK 比對(duì)酶學(xué)性質(zhì)和動(dòng)力學(xué)參數(shù)，測(cè)定固定化酶 Fe3O4@Histidine-Ni/ uMtCK 的重復(fù)使用次數(shù)。

與游離酶 uMtCK 相比，固定化酶 Fe3O4@Histidine- Ni/uMtCK 的最適反應(yīng)溫度提高5 ℃，最適 pH 降低 0.5 個(gè)單位，在50 ℃、pH 7.5 下孵育 2 h，殘余酶活為 51%，而游離酶僅為 27%；uMtCK 的K為 10.7 mmol/L，為 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 的 1.1 倍；Fe3O4@Histidine- Ni/uMtCK 的k/K值是 5.3 L/(mmol·s)，是 uMtCK 的 1.3 倍；Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 在經(jīng)歷 9 次循環(huán)使用后，活力還能保持 50 % 以上，顯示了良好的穩(wěn)定性和重復(fù)使用性。

與 uMtCK 相比，F(xiàn)e3O4@Histidine-Ni/uMtCK 具有良好的熱穩(wěn)定性和重復(fù)使用性，具有一定的工業(yè)化價(jià)值。

酶類，固相； 肌酸激酶； 磷酸肌酸

磷酸肌酸（creatine phosphate，CrP）是脊椎動(dòng)物細(xì)胞能量代謝中發(fā)揮重要作用的高能磷酸化合物[1]，在如心臟、大腦和骨骼肌等高能量需求的器官中，CrP 對(duì)于能量的平衡起著至關(guān)重要的作用[1]。肌原纖維的收縮[2]、葡萄糖的攝取[3]以及蛋白質(zhì)的合成[4]均依賴 CrP 的供能。磷酸肌酸在臨床上應(yīng)用廣泛，現(xiàn)已證實(shí)外源性磷酸肌酸可維持術(shù)后體內(nèi)高能磷酸水平和心肌細(xì)胞的正常能量代謝，保護(hù)磷脂膜而使細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，保護(hù)心肌，使心臟正常收縮，降低心臟不良事件的發(fā)生。心血管治療及其輔助治療藥物具有巨大的市場(chǎng)潛力，注射用磷酸肌酸鈉作為心肌保護(hù)藥物年銷售額過(guò)十億。

現(xiàn)階段磷酸肌酸鈉的合成主要有化學(xué)合成法和酶法合成?；瘜W(xué)合成方法產(chǎn)率較低，純化工藝復(fù)雜、條件苛刻，易有重金屬殘留，且工業(yè)三廢和有毒有害物質(zhì)用量較大，不利于環(huán)保。

酶的蛋白質(zhì)屬性決定了其催化條件溫和、反應(yīng)高效和底物的高度選擇性等特點(diǎn)，而且酶作為一類生物催化劑，可以實(shí)現(xiàn)許多化學(xué)合成難以實(shí)現(xiàn)的反應(yīng)，并且對(duì)環(huán)境友好。但是游離酶催化后不能收回，無(wú)法實(shí)現(xiàn)連續(xù)催化反應(yīng)，因此酶的固定化在工業(yè)上應(yīng)用越來(lái)越廣泛。常見的酶固定化材料包括天然聚合物[5]、合成聚合物[6]、多孔介質(zhì)[7]以及磁性介質(zhì)[8]，其中磁性納米材料具有比表面積大、回收迅速和工藝簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。

在脊椎動(dòng)物體內(nèi)，肌酸激酶（creatine kinase，CK，EC 2.7.3.2）催化肌酸和腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）可逆生成 CrP 和腺嘌呤核苷二磷酸（ADP）（圖 1），通過(guò)此步反應(yīng)可以維持脊椎動(dòng)物體內(nèi)能量循環(huán)的穩(wěn)定[9-10]。前期研究已采用雜化密度泛函理論方法對(duì)人類線粒體肌酸激酶（uMtCK）的催化機(jī)制進(jìn)行了詳細(xì)的闡述[11]，并對(duì)底物結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了詳細(xì)的分析[12]，基于 uMtCK 所顯示出的催化活性和穩(wěn)定性，具有一定的工業(yè)化生產(chǎn) CrP 的潛能，本文擬通過(guò)納米級(jí)磁性材料 Fe3O4@Histidine-Ni[13]固定化的方法探討 uMtCK 的工業(yè)化應(yīng)用。

本文通過(guò)將 uMtCK 固定在納米級(jí)磁性材料 Fe3O4@Histidine-Ni 上[14]，進(jìn)而催化 Cr 和 ATP 生成 CrP 和 ADP 反應(yīng)的研究，比較游離酶和固定化酶酶學(xué)和動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，測(cè)定重復(fù)使用批次，探討磁性材料 Fe3O4@Histidine-Ni 固定化 uMtCK 工業(yè)化應(yīng)用的可能性。

圖 1 肌酸激酶的催化反應(yīng)

Figure 1 The catalytic reaction of creatine kinase

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與試劑 uMtCK 表達(dá)菌株BL21(DE3) 購(gòu)自美國(guó)Novagen 公司；表達(dá)質(zhì)粒pET-28CK 為前期本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[11]；Cr 和 ATP 均購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司；蛋白胨和酵母膏購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher 公司；30 K 超濾濃縮管購(gòu)自美國(guó)Millipore 公司；肌酸激酶活性測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB 培養(yǎng)基：蛋白胨 10 g/L、酵母膏 5 g/L、NaCl 10 g/L，121 ℃滅菌 15 min。

1.2 方法

1.2.1 重組 uMtCK 的表達(dá)與純化[11]將實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的表達(dá) uMtCK 工程菌株經(jīng)平板活化，轉(zhuǎn)接在 LB 培養(yǎng)基（包含 Kan 50 μg/ml），37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)過(guò)夜后轉(zhuǎn)接相同的條件培養(yǎng)到600值為 0.6 ~ 0.8，然后加入 0.2 mmol/L IPTG，18 ℃、200 r/min 誘導(dǎo)表達(dá) 16 h。收集誘導(dǎo)培養(yǎng)的菌體 4000 r/min，4 ℃離心 10 min，倒掉上清后用 Lysis buffer（20 mmol/L 磷酸緩沖液、500 mmol/L NaCl、10 mmol/L 咪唑，pH 7.4）重懸，利用高壓均質(zhì)機(jī)破碎 2 遍，18 000 r/min、4 ℃離心 30 min，收集上清備用。由于 pET-28a(+) 帶有 His6標(biāo)簽，因此可選用 TALON? Metal Affinity Resin 來(lái)進(jìn)行目的蛋白的純化。首先將收集的上清用0.45 μm 濾膜過(guò)濾，然后與經(jīng) Lysis buffer 平衡后的基質(zhì)在4 ℃下結(jié)合 1 h，然后用 Washing buffer（20 mmol/L 磷酸緩沖液、500 mmol/L NaCl、20 mmol/L 咪唑，pH 7.4）5 倍柱體積沖洗，最后用 Elution buffer（20 mmol/L 磷酸緩沖液、500 mmol/L NaCl、500 mmol/L 咪唑，pH 7.4）洗脫目的蛋白，經(jīng) SDS-PAGE 檢測(cè)后將目的蛋白用 30 K 超濾濃縮管進(jìn)行脫鹽濃縮后備用。

1.2.2 重組 uMtCK 的固定化 取一定量純化后的 uMtCK 與磁性材料Fe3O4@Histidine-Ni 在20 mmol/L Tris和 150 mmol/L NaCl，pH 8.0 下結(jié)合 2 h，利用磁鐵吸附填料，并測(cè)定上清未固定蛋白的量，與目的蛋白初始量相減從而確定固定蛋白的量。

1.2.3 uMtCK 及其突變體的活性測(cè)定 使用肌酸激酶活性測(cè)定試劑盒，根據(jù)肌酸激酶反應(yīng)原理，通過(guò)在 35 ℃、pH 7.5 條件下，測(cè)定 λ660 nm磷鉬酸鹽顯色來(lái)表征活性。

1.2.4 游離酶 uMtCK 和固定化酶 Fe3O4@ Histidine-Ni/uMtCK 酶學(xué)性質(zhì)分析

1.2.4.1 最適反應(yīng)溫度的測(cè)定 將 uMtCK 和 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 在不同溫度（20、30、35、40、45、50和 60 ℃），pH 7.5 的條件下測(cè)定酶活性，將最高活力定為 100%。

1.2.4.2 溫度穩(wěn)定性的測(cè)定 測(cè)定uMtCK 和 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK在 50 ℃、pH 7.5 不同保溫時(shí)間的殘余酶活，將 uMtCK 和 Fe3O4@ Histidine-Ni/uMtCK 在50 ℃、pH 7.5 下孵育 2.5 h，每半小時(shí)取樣后在冰上孵育 5 min 后測(cè)定活性，0 h的活性為 100%。

1.2.4.3 最適反應(yīng) pH 的測(cè)定 40 ℃下測(cè)定uMtCK 和 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 在不同 pH 值（4.0、5.0、6.0、7.0、7.5、8.0 和 9.0）的活性，將測(cè)得的最高活力定為100%。

1.2.4.4 pH 穩(wěn)定性的測(cè)定 將 uMtCK 和 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 在pH 5.0、40 ℃下孵育 2.5 h，每半小時(shí)取樣在冰上孵育 5 min 后測(cè)定活性，以pH 5.0、40 ℃下孵育 0 h 的活性為 100%。

1.2.5 uMtCK 和 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 酶動(dòng)力學(xué)分析

1.2.5.1 K值的測(cè)定 以不同濃度（1、2、5、7、10、15、20 和 30 mmol/L）肌酸、20 mmol/L Tris（pH 7.5）、150 mmol/L NaCl、5 mmol/L ATP 為底物，分別加入一定量的 uMtCK 或 Fe3O4@Histidine- Ni/uMtCK，35 ℃反應(yīng) 5 min，測(cè)定uMtCK 在不同底物濃度的反應(yīng)體系中的活性，通過(guò)軟件 GraphPad Prism v5.0 中 Michaelis-Menten 方程計(jì)算酶反應(yīng)的V和K。

1.2.5.2K值的測(cè)定 不同濃度（0.1、0.2、0.4、0.6、1、1.6、4 和 8 mmol/L）ATP、25 mmol/L Cr、5 mmol/L Mg2+為底物，在20 mmol/L Tris（pH 7.5）、150 mmol/L NaCl 下分別加入適量 uMtCK 或 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK，35 ℃反應(yīng) 5 min，測(cè)定 uMtCK 在不同 ATP 濃度的反應(yīng)體系中的活性，通過(guò)軟件 GraphPad Prism v5.0 中 Michaelis- Menten 方程以計(jì)算酶反應(yīng)的V和K。

1.2.5.3 催化常數(shù)k值的測(cè)定 已知酶濃度，根據(jù)測(cè)得的V值以及公式V=k[E] 計(jì)算k值，其中[E] 代表酶的濃度。

1.2.6 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 重復(fù)使用次數(shù)分析 通過(guò)測(cè)定 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 重復(fù)使用 15 次的酶活性，確定固定化 uMtCK 的重復(fù)使用批次，活性測(cè)定方法同 1.2.3，每次吸附磁性材料除去上清后，用 1 倍柱體積的緩沖液（20 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl，pH 7.5）清洗磁性材料，第一次測(cè)定的活性記為 100%。

2 結(jié)果

2.1 uMtCK 的表達(dá)與純化

利用實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的表達(dá)菌株 BL21(DE3)/ pET-28CK 在 0.2 mmol/L IPTG、20 ℃、12 h 條件下誘導(dǎo) uMtCK 的表達(dá)，利用 Co2+親和樹脂和分子排阻色譜 Superdex 75 10/300 GL 純化后，經(jīng) SDS-PAGE 檢測(cè)，結(jié)果見圖 2。利用 30 kD 超濾管更換蛋白緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl、150 mmol/L NaCl、1 mmol/L DTT、10% 甘油，pH 8.0）備用。

M：蛋白分子量標(biāo)記；1：uMtCK

Figure 2 SDS-PAGE analysis of uMtCK

2.2 掃描電子顯微鏡分析

為研究固定化酶對(duì) Fe3O4@Histidine-Ni 材料的粒徑大小和形貌的影響，本研究利用掃描電子顯微鏡分析了未固定化 Fe3O4@Histidine-Ni（圖 3A）材料和固定化后的Fe3O4@Histidine-Ni 材料（圖 3B）。結(jié)果顯示，未固定化 Fe3O4@Histidine-Ni 材料和固定化后的 Fe3O4@Histidine-Ni 材料的粒徑均在 20 ~ 30 nm，且均成圓粒狀，固定化酶對(duì) Fe3O4@Histidine-Ni 材料無(wú)明顯的性狀影響。

2.3 uMtCK 和 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 的酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 溫度對(duì)酶活性的影響 在不同溫度（20、30、35、40、45、50、60 ℃）、pH 7.5 下測(cè)定 uMtCK 和 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 的活力，結(jié)果如圖 4A 所示，uMtCK 的最適溫度為 35 ℃，F(xiàn)e3O4@Histidine-Ni/uMtCK 的最適作用溫度為40 ℃，比 uMtCK 的最適反應(yīng)溫度高 5 ℃。

圖 3 掃描電子顯微鏡分析Fe3O4@Histidine-Ni（A）及Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK（B）

Figure 3 SEM images of Fe3O4@Histidine-Ni (A) and Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK (B)

圖 4 溫度對(duì)uMtCK 和Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 的影響

Figure 4 Effects of temperature on uMtCK and Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK

圖 5 pH 對(duì)uMtCK 和Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 的影響

Figure 5 Effects of pH on uMtCK and Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK

在50 ℃，pH 7.5 條件下測(cè)定 uMtCK 和 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 的穩(wěn)定性，由圖4B 結(jié)果顯示，固定化酶 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 孵育 2 h 以后殘余 51% 的活性，而 uMtCK 僅殘余 27% 的活性。

2.3.2 pH 對(duì)酶活性的影響 在不同 pH 值（4.0、5.0、6.0、7.0、7.5、8.0 和 9.0）、40 ℃下測(cè)定uMtCK 和 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 的活力，結(jié)果如圖 5A 所示，uMtCK 的最適 pH 為 7.5，F(xiàn)e3O4@Histidine-Ni/uMtCK 的最適 pH 為 7.0，比 uMtCK 降低了 0.5個(gè)單位。

在pH 5.0、40 ℃測(cè)定 uMtCK 和 Fe3O4@ Histidine-Ni/uMtCK 的殘余活性，結(jié)果如圖 5B 所示，uMtCK 和 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 的殘余活性變化基本一致。

2.4 uMtCK 游離酶和固定化酶動(dòng)力學(xué)性質(zhì)

利用不同濃度肌酸為底物，在 35 ℃、pH 7.5 中測(cè)得在 λ660 nm下吸光度的變化。通過(guò)軟件 GraphPad Prism v5.0 中 Michaelis-Menten 方程計(jì)算酶反應(yīng)的V和K，并計(jì)算k值。結(jié)果如表 1 所示，在 35 ℃、pH 7.5 的情況下，游離酶 uMtCK 的K為 10.7 mmol/L，為Fe3O4@ Histidine-Ni/uMtCK 的 1.1 倍；Fe3O4@Histidine- Ni/uMtCK 的k/K值是 5.3 L/(mmol·s)，是 uMtCK 的 1.3 倍。

表 1 uMtCK 和 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK催化動(dòng)力學(xué)常數(shù)

2.5 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 重復(fù)使用次數(shù)分析

可重復(fù)使用次數(shù)是評(píng)價(jià)固定化酶的一個(gè)重要指標(biāo)，F(xiàn)e3O4@Histidine-Ni/uMtCK 重復(fù)使用次數(shù)分析結(jié)果如圖 6 所示，F(xiàn)e3O4@Histidine-Ni/uMtCK 在經(jīng)歷 9 次循環(huán)使用后，活力還能保持 50% 以上，顯示了良好的穩(wěn)定性和重復(fù)使用性。

圖 6 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 重復(fù)使用次數(shù)分析

Figure 6 Reusability of Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK

3 討論

眾所周知，游離酶在工業(yè)化應(yīng)用中需要面對(duì)產(chǎn)物純化過(guò)程中的二次處理，工藝復(fù)雜且酶不可重復(fù)利用[14]；而固定化酶具有可重復(fù)利用和穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)從而在工業(yè)中廣泛應(yīng)用。已有部分研究發(fā)現(xiàn)固定化會(huì)提高酶的耐熱性[15-17]，本研究中，相較于游離酶 uMtCK，F(xiàn)e3O4@Histidine-Ni/uMtCK 的最適溫度提高 5 ℃，且在 50 ℃、pH 7.5 條件下，F(xiàn)e3O4@Histidine-Ni/uMtCK 孵育 2 h 以后殘余 51% 的活性，耐熱性的提高有助于固定化酶適應(yīng)各種工藝要求，拓寬其使用范圍，且溫度的提高有助于增加反應(yīng)速率[18]，從而提高其催化效率，降低生產(chǎn)成本。由于 uMtCK 催化合成 CrP 的反應(yīng)釋放質(zhì)子，因此 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 最適反應(yīng) pH 降低 0.5 個(gè)單位有助于酶在產(chǎn)物濃度較高的情況下繼續(xù)反應(yīng)。在每次更換反應(yīng)物帶來(lái)的酶損失和機(jī)械力等造成酶變形的不利條件下，固定化酶的重復(fù)使用次數(shù)基本在 5 ~ 15 次[19]。本研究中 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK在重復(fù)使用 9 次的情況下，能保持殘余活性高于 50%，顯示出磁性材料 Fe3O4@Histidine-Ni 固定化 uMtCK 工業(yè)化應(yīng)用的潛力。

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Ubiquitous mitochondrial creatine kinase fromimmobilized on magnetic nanoparticles and its enzymatic properties in creatine phosphate production

LYU Guang-xin, SHI Bei-chen, FAN Shuai, YANG Zhao-yong, ZHANG Zhi-fei, CHEN Jing

School of Basic Medical Science (LYU Guang-xin, CHEN Jing), School of Pharmacy (SHI Bei-chen, ZHANG Zhi-fei), North China University of Science and Technology, Tangshan 063210, China; Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 10050, China (FAN Shuai, YANG Zhao-yong)

Ubiquitous mitochondrial creatine kinase (uMtCK), belonging to the guanidino kinase superfamily, is reported to catalyze the transformation of creatine into creatine phosphate through the reaction of phosphorylation, making it a highly promising enzyme for the industrial production of creatine phosphate. We aim to develop an immobilized uMtCK for the use of industrial production of creatine phosphate.

The uMtCK stabilized on Fe3O4@Histidine-Ni magnetic nanoparticles, the surfaces of which were modified by Ni2+-immobilized cross-linked Fe3O4@Histidine. The enzyme characterization and enzyme kineticsof the immobilized enzyme Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK was investigated and compared with that of free enzyme uMtCK.

Theoptimum temperature of Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK was higher than that of the uMtCK. The ranges of its pH optimum was decreased about 0.5 unit. Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK exhibited stronger tolerance towards a higher thermostability without obvious difference in a lower pH when compared with the uMtCK. TheKvalue of uMtCK was 1.1 folds higher than that of the Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK, and thek/Kvalues of Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK was 1.3 higher than that of the uMtCK. Furthermore, the Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK maintained 50 % of its original activity after 9 cycles of reuse.

The Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK obtained in the study is efficient with potential application in biocatalytic production of creatine phosphate.

Enzymes, immobilized; Creatine kinase; Creatine phosphate

CHEN Jing, Email: chjingchuchu@hotmail.com; ZHANG Zhi-fei, Email: zhifeiz@outlook.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.04.003

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81872782）；中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程（2016-I2M-3-022）

陳靜，Email：chjingchuchu@hotmail.com；張志斐，Email：zhifeiz@outlook.com

2019-04-12

*同為第一作者