唐榮金，曾憲華，石海林，孫文國，向雪寶，蔣雷鳴，高漓

（桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 泌尿外科，廣西 桂林 541001）

丹參酮IIA（tanshinone IIA, TanIIA）是來源于中藥丹參的有效提取物，既往研究認(rèn)為TanIIA具有抗炎癥反應(yīng)的功效，可預(yù)防血管粥樣硬化及心肌肥厚，減輕因缺血再灌注引起的腎損[1-2]。近年，TanIIA對惡性腫瘤的抗癌作用及其機(jī)制研究也得到越來越多的關(guān)注，但是對于其在膀胱癌的作用研究卻少見[3]。本研究擬探索TanIIA對人膀胱癌T24細(xì)胞增殖及凋亡的作用及對細(xì)胞周期蛋白B1（CyclinB1）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3信使核糖核酸（Caspase-3 mRNA）表達(dá)的影響，旨在為治療膀胱癌探尋一條低毒高效的道路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑

人膀胱癌T24細(xì)胞株購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。DMEM（Dulbecco's modified eagle medium, DMEM）培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；MTT（美國Sigma公司）；AnnexinV/ PI雙染試劑盒（凱基生物）；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）試劑盒（美國Promega公司）；引物及內(nèi)參引物及內(nèi)參（上海生工生物工程公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞。每3 d換液1次，并傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)細(xì)胞至對數(shù)生長期。

1.2.2 MTT檢測細(xì)胞增殖 取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)1×104。培養(yǎng)板放入箱中，在37℃、5% CO2條件下細(xì)胞培養(yǎng)24 h培養(yǎng)。取出培養(yǎng)板，加入不同濃度（5 mg/L和10 mg/L）TanIIA，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育48 h。MTT稀釋后，在37℃孵育4 h，每孔加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）150 ul，充分振蕩10 min。用酶標(biāo)儀在570 nm波長下檢測各孔的吸光度。細(xì)胞存活率=［加藥細(xì)胞光密度（optical density, OD）/對照細(xì)胞OD］×100%。

1.2.3 AnnexinV/PI檢測細(xì)胞凋亡 將TanIIA處理T24細(xì)胞48 h，后按AnnexinV/PI試劑盒說明書操作。

1.2.4 RT-PCR 檢測CyclinB1和Caspase-3 mRNA取與1.2.2同組的T24細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，參照RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

用SSPS 19.0統(tǒng)計軟件處理分析所得數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用多個樣本均數(shù)間兩兩比較的方差分析，各組間比較應(yīng)用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測TanIIA對人膀胱癌T24細(xì)胞體外增殖的影響

MTT結(jié)果顯示：不同濃度TanIIA對膀胱癌T24細(xì)胞有抑制作用，而且隨著濃度的增加，增殖抑制愈加明顯，呈濃度依賴性，各組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 不同濃度TanII對T24細(xì)胞增殖的影響（MTT法） （±s，%）

表1 不同濃度TanII對T24細(xì)胞增殖的影響（MTT法） （±s，%）

注：1）與空白對照組對比，P＜0.05；2）與5 mg/L對比，P ＜0.05。

藥物濃度 48 h存活率空白對照組 0.942±0.072 5 mg/L 0.753±0.0461）10 mg/L 0.529±0.0531）2）

2.2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

AnnexinV/PI結(jié)果顯示，凋亡率分別隨著濃度增長而增加，呈濃度依賴性，各組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 不同濃度TanII對T24細(xì)胞凋亡率的影響（AnnexinⅤ/PI法） （±s，%）

表2 不同濃度TanII對T24細(xì)胞凋亡率的影響（AnnexinⅤ/PI法） （±s，%）

注：1）與空白對照組對比，P＜0.05；2）與5 mg/L對比，P ＜0.05。

藥物濃度 48 h凋亡率空白對照組 0.453±0.047 5 mg/L 7.428±0.5811）10 mg/L 12.742±1.4741）2）

2.3 RT-PCR檢測T24細(xì)胞中CyclinB1和Caspase-3 mRNA的表達(dá)

RT-PCR分別檢測處理48 h后T24細(xì)胞的CyclinB1和Caspase-3 mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CyclinB1 mRNA表達(dá)隨TanIIA濃度增高而下調(diào)，而Caspase-3 mRNA則表達(dá)上調(diào)，兩者均呈濃度依賴性，各組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 RT-PCR檢測不同濃度TanIIA處理T24細(xì)胞48 h后CyclinB1和Caspase-3 mRNA的表達(dá)（n =4） （±s）

表3 RT-PCR檢測不同濃度TanIIA處理T24細(xì)胞48 h后CyclinB1和Caspase-3 mRNA的表達(dá)（n =4） （±s）

注：1）與空白對照組對比，P＜0.05；2）與5 mg/L對比，P ＜0.05。

藥物濃度 CyclinB1 Caspase-3 t值 P值空白對照組 0.291±0.027 0.163±0.031 2.76 0.013 5 mg/L 0.204±0.0211 0.307±0.0741） -3.931 0.001 10 mg/L 0.138±0.0161）2） 0.537±0.0521）2） -28.74 0.000

3 討論

膀胱癌在惡性腫瘤中位居第7位，大部分為尿路上皮癌，其中局限性尿路上皮癌可分為肌層非浸潤性膀胱癌（non muscular-invasive bladder cancer, NMIBC）和肌層浸潤性膀胱癌（muscular-invasive bladder cancer, MIBC），NMIBC約 占75%～80%，MIBC及發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者往往需要根治性膀胱切除、化療或放療[4]。即使行膀胱癌根治性切除術(shù)，仍可能有約1/2的MIBC患者發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，然而無論是經(jīng)典的順鉑方案，還是近來迅速發(fā)展的靶向治療，均存在有效率不明確且副作用較為明顯的特點(diǎn)[5]。因此，如何在祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)寶庫中發(fā)現(xiàn)一條低毒高效的膀胱癌治療道路，已成為腫瘤學(xué)的研究熱點(diǎn)。

TanIIA作為中藥丹參的有效成份之一，具有脂溶性，除了應(yīng)用于心血管等疾病，擁有抗氧化、抗炎癥等特點(diǎn)外，近年來不斷有研究發(fā)現(xiàn)，TanIIA對于鼻咽癌、胃癌、口腔癌、食管癌、肺癌及肝癌等細(xì)胞株具有抗癌作用[6-11]。TanIIA通過下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶線粒體膜電位-2DNA修復(fù)酶（mitochondrial membrane potential-2 poly ADP-ribose polymerase, MMP-2PARP） 和 MMP-6明 顯抑制鼻咽癌細(xì)胞系人中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶-1D（human neutrophil elastase-1D, HNE-1D）的增殖及轉(zhuǎn)移、侵襲能力[6]。TanIIA可能通過Ras/Raf/MEK/ERK通路誘導(dǎo)和Caspase-3表達(dá)上調(diào)，增加胃癌細(xì)胞株AGS的凋亡[7]。本研究發(fā)現(xiàn)TanIIA可以抑制膀胱癌細(xì)胞系T24增殖并且誘導(dǎo)其凋亡，其抗膀胱癌作用可能與抑制細(xì)胞周期蛋白CyclinB1，增加細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Caspase-3有關(guān)。

CyclinB1在G2/M期起重要的調(diào)控作用，在S末期及G2早期開始合成，M期達(dá)到高峰，驅(qū)動G2期轉(zhuǎn)換至M期，并與P34cdc2結(jié)合促使細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂，M后期，在Sic1作用下CyclinB1降解及P34cdc2磷酸化，使得染色體分離，有絲分裂完成[12]。G2期出現(xiàn)DNA損傷時抑制CyclinB1/周期蛋白依賴性激酶1（cyclin-dependent kinase 1，CDK1）活性，阻止細(xì)胞周期的進(jìn)行，研究提示CylinB1的表達(dá)失調(diào)會導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生[13]。因此，本研究提示TanIIA可能抑制CyclinB1的過表達(dá)，使得膀胱癌T24細(xì)胞停滯在G2/M期，抑制惡性腫瘤細(xì)胞的增殖。Caspase-3作為Caspase家族蛋白成員，在細(xì)胞凋亡中起著重要作用，是執(zhí)行過程的關(guān)鍵酶，可以被外源性或內(nèi)源性路徑激活，研究發(fā)現(xiàn)一些中草藥的成份可以增加Caspase-3的表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡[14]。因此，類似其他研究[14]，Caspase-3的表達(dá)上調(diào)誘導(dǎo)T24細(xì)胞凋亡增加，可能也是TanIIA發(fā)揮抗膀胱癌作用的機(jī)制之一。

雖然，本研究提示TanIIA可能通過抑制CyclinB1和增加Caspase-3的表達(dá)發(fā)揮抗膀胱癌細(xì)胞株的作用，并且證實TanIIA具有濃度依賴性。但是對于TanIIA時間依賴性缺乏探討，而且本研究為體外研究，若要進(jìn)一步證實TanIIA的抗膀胱癌作用，則需要進(jìn)一步完善膀胱癌細(xì)胞裸鼠移植瘤的體內(nèi)實驗，同時對于具體調(diào)控通路的研究也是今后探索方向。