申　敏

熒光PCR技術(shù)在釀酒酵母細(xì)胞測(cè)定中的應(yīng)用

申敏

（長(zhǎng)治職業(yè)技術(shù)學(xué)院山西長(zhǎng)治046000）

聚合酶反應(yīng)（PCR）作為一種敏感特意的核酸分子定性檢測(cè)的方法，在基因診斷中有著重要的作用，可是傳統(tǒng)PCR技術(shù)存在著諸多無(wú)法攻陷的難關(guān)，比如PCR后需要進(jìn)行手工操作，無(wú)法定量，PCR產(chǎn)物容易污染等。隨著科技的發(fā)展，實(shí)時(shí)PCR技術(shù)誕生，有效的解決了傳統(tǒng)PCR技術(shù)的弊端，實(shí)現(xiàn)了定量分析，因此其被廣泛的用于食品工程中。文章采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)應(yīng)用于測(cè)定果汁中釀酒酵母細(xì)胞的含量，確立了一種實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性，提升了檢測(cè)效率。

熒光PCR技術(shù)；釀酒酵母細(xì)胞；DNA

實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)是將傳統(tǒng)PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，逐漸發(fā)展而來(lái)的一種核酸定量技術(shù)，其被用于細(xì)胞研究中，是一種常見(jiàn)的細(xì)胞研究方式。借助熒光PCR技術(shù)能夠更加立體而又直觀的觀察肉眼所及的生命現(xiàn)象。當(dāng)前，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)被普遍用于轉(zhuǎn)基因成分、動(dòng)植物病毒、臨床樣品以及微生物等不同生物成分的檢測(cè)。筆者將實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)用于探測(cè)果汁中的釀酒酵母細(xì)胞的含量，提升了檢測(cè)效率，明確了檢測(cè)方法的靈敏度與特異性。

1 材料和方法

1.1 材料和設(shè)備

基因提取試劑盒、ABI7300 型熒光PCR儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

測(cè)定釀酒酵母的檢出下限。溫度：28 ℃；時(shí)間：24 h。在1ml培養(yǎng)液中采用酵母基因組提取試劑盒提取其中的DNA，將提取出來(lái)的DNA進(jìn)行稀釋。同時(shí)，選擇七份均為1ml的培養(yǎng)液，標(biāo)號(hào)1、2、3……7，其中培養(yǎng)液1為原液，培養(yǎng)液2-7以10 、100 、1000 ……的倍率稀釋?zhuān)脙A注平板法計(jì)算培養(yǎng)液中的菌落數(shù)量，為了提升計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性，不同培養(yǎng)液重復(fù)計(jì)算兩次。

測(cè)定果汁樣品中釀酒酵母的檢出下限。把1 ml的釀酒酵母培養(yǎng)液接種在20 ml的蘋(píng)果汁、橙汁以及葡萄汁中。培養(yǎng)場(chǎng)所：生化培養(yǎng)箱；溫度：30 ℃；時(shí)間：48 h。采用酵母基因組提取盒在1ml果汁培養(yǎng)液中提取釀酒酵母DNA，將提取出的DNA溶液分成七份，分別標(biāo)號(hào)a、b、c……g，分別以10 、100 、1 000 ……的倍率進(jìn)行稀釋處理，利用實(shí)時(shí)熒光技術(shù)對(duì)果汁中所存在的釀酒酵母進(jìn)行檢出下限測(cè)定。同時(shí)選取1ml果汁培養(yǎng)液從10-1以10 倍稀釋度的方法一直稀釋到10-6，不同稀釋度分別選取1ml的培養(yǎng)液，采用傾注平板法對(duì)菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，不同的稀釋度要進(jìn)行兩次重復(fù)試驗(yàn)，驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

測(cè)定不同濃度釀酒酵母DNA溶液的檢出下限，從圖1可知，不同濃度的DNA溶液都能夠獲得擴(kuò)增曲線，而采用無(wú)菌雙蒸水作為空白對(duì)照進(jìn)行測(cè)定，則不存在擴(kuò)增曲線。有結(jié)果可知，培養(yǎng)液中釀酒酵母濃度是7×105cfu/mL。

圖1　實(shí)施熒光纖維技術(shù)測(cè)定釀酒酵母檢出下限

注：1-8是原液、不同濃度溶液以及空白組擴(kuò)增曲線。

果汁中釀酒酵母的測(cè)定結(jié)果如圖2所示，不論是原液還是稀釋到不同的濃度，都存在顯著的擴(kuò)增曲線，無(wú)菌雙蒸水空白組沒(méi)有出現(xiàn)擴(kuò)增。最終結(jié)果表明，釀酒酵母在蘋(píng)果汁、橙汁、葡萄汁中的濃度分別是1.2×106、7×105、1.6×106cfu/mL。

圖2　釀酒酵母在橙汁中檢出下限

注：1-9分別為橙汁DNA原液、不同濃度、空白對(duì)照組擴(kuò)增曲線。

圖3　釀酒酵母在蘋(píng)果汁中的檢出下限

注：1-9分別為蘋(píng)果汁DNA原液、不同濃度、空白對(duì)照組擴(kuò)增曲線。

本研究試圖構(gòu)建一種快速的果汁釀酒酵母熒光纖維檢測(cè)方法，采用這種方法對(duì)樣本當(dāng)中的釀酒酵母進(jìn)行檢測(cè)，整個(gè)過(guò)程只需要5h，可以及時(shí)的反映過(guò)程中樣本、環(huán)境的污染情況，為生產(chǎn)進(jìn)程中產(chǎn)品質(zhì)量控制提供了有效而又快速的檢測(cè)方法。

[1]曹春蕾,曹正鋒,趙運(yùn)英.熒光顯微技術(shù)在釀酒酵母細(xì)胞研究中的應(yīng)用[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué),2018,37(4):1539-1546.

[2]洪志強(qiáng),方梅,陸巧榮.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在結(jié)核分枝桿菌研究中的應(yīng)用[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2010,37(2):346-348.

10.3969/j.issn.2095-1205.2019.05.31

申敏（1987- ），女，山西潞城人，碩士，研究方向：食品生物技術(shù)。

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2095-1205(2019)05-54-02