王振宇 李偉建 張洪丹 景宏舒 袁天杰 彭媛 鄢和新 翟博

HepG2細(xì)胞是一種已經(jīng)被廣泛表征的人肝癌細(xì)胞系，具有諸如容易大量獲取，易處理和無(wú)限壽命等優(yōu)點(diǎn)，是最常用的肝細(xì)胞模型；然而，HepG2較低的肝細(xì)胞功能，在一定程度上妨礙了其的應(yīng)用[1]。

研究報(bào)道，一些特定小分子具有改善肝細(xì)胞功能，促進(jìn)細(xì)胞分化的作用，采用含有特定小分子組合的肝細(xì)胞成熟培養(yǎng)基(HMM)可成功將肝細(xì)胞衍生的肝祖細(xì)胞樣細(xì)胞(HepLPC)分化為成熟肝細(xì)胞[2-6]。本研究觀察了這種新型肝細(xì)胞成熟培養(yǎng)基對(duì)HepG2的作用，并以此為基礎(chǔ)建立新的三維HepG2培養(yǎng)體系，旨在降低因HepG2低功能帶來(lái)的不利影響，更好的服務(wù)于相關(guān)研究。

資料與方法

一、 細(xì)胞培養(yǎng)

冷凍保存的HepG2細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院(上海)細(xì)胞庫(kù)。37℃水浴解凍后，將細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清(Biological Industries)和1%青鏈雙抗(源培生物科技股份有限公司)的DMEM(源培生物科技股份有限公司)中，然后將細(xì)胞置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每2～3天更換一次培養(yǎng)基，細(xì)胞覆率超過(guò)80%時(shí)使用0.25%的胰酶(源培生物科技股份有限公司)進(jìn)行消化，并按照1∶3～6的比例接種入新的培養(yǎng)皿中。

二、 HepG2的2D功能提升培養(yǎng)

將狀態(tài)良好的HepG2接種在細(xì)胞培養(yǎng)板中，并在DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)1～3 d直至細(xì)胞覆率達(dá)到60%～80%。然后將培養(yǎng)基更換為肝細(xì)胞成熟培養(yǎng)基(HMM)[5-6]。另外培養(yǎng)7～9 d以誘導(dǎo)HepG2的功能提升。HMM基于DMEM/F12，補(bǔ)充有N2和B27(均購(gòu)自源培生物科技股份有限公司),10 μmol DAPT(TargetMol)，20 ng/mL OSM(Peprotech)，10 μmol地塞米松(Sigma-Aldrich)，10 μmol SB431542(TargetMol)。培養(yǎng)基每2～3天更換1次，誘導(dǎo)前后的顯微照片使用Nikon Ta2-FL捕獲。

三、 HepG2的3D功能提升培養(yǎng)

將狀態(tài)良好的HepG2以1～2×106每孔的數(shù)量接種入6孔低黏附板(CORNING)。細(xì)胞最初培養(yǎng)于DMEM完全培養(yǎng)基中，24～48 h形成穩(wěn)定的3D結(jié)構(gòu)。之后，將培養(yǎng)基更換為HMM培養(yǎng)7～9 d，以進(jìn)一步提升肝功能。 培養(yǎng)基每2～3天更換1次。

四、 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

使用Trizol試劑(碧云天生物科技有限公司)提取總RNA，使用BeyoRTTMIII cDNA第一鏈合成試劑盒(碧云天生物科技有限公司)合成cDNA。 通過(guò)使用ABI 7 300PLUS實(shí)時(shí)PCR儀(Life Technologies)和SYBR Green qPCR Mix(2X，High ROX)(碧云天生物科技有限公司)進(jìn)行QPCR分析。使用ΔΔCt方法分析基因轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)并歸一化到管家基因18s。 引物由上海華津生物科技有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

五、過(guò)碘酸-希夫染色

使用南京建成生物工程研究所的糖原染色試劑盒進(jìn)行過(guò)碘酸-希夫染色以檢測(cè)糖原合成情況，染色完成后使用Nikon Ta2-FL拍攝顯微圖像。

六、尿素檢測(cè)

在含有3 mmol NH4Cl的HMM中培養(yǎng)2D及3D培養(yǎng)物。NH4Cl誘導(dǎo)后24 h收集上清液。QuantiChromTM尿素測(cè)定試劑盒(BioAssy Systems，USA)檢測(cè)尿素濃度。 所有數(shù)據(jù)均經(jīng)過(guò)時(shí)間和總蛋白量校正。

七、氯丙嗪毒性檢測(cè)

將1×106的HepG2細(xì)胞接種在384孔微球板中(CORNING)，并以200×g離心3 min。 接種2～3 d后，將50%的培養(yǎng)基更換為HMM或者新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基。之后，每隔1天更換50%的培養(yǎng)基。培養(yǎng)9 d后，將細(xì)胞球暴露于一定濃度梯度的氯丙嗪中，暴露48 h后，使用PrestoBlueTMCell Viability Reagent(Invitrogen)定量細(xì)胞活力。毒性結(jié)果總結(jié)為歸一化的劑量依賴性毒性曲線和50%毒性濃度(TC50)值。

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

通過(guò)GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用student’st檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 引物序列

結(jié) 果

一、 HMM明顯提高了HepG2的肝細(xì)胞功能

相對(duì)于DMEM培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞(HepG2-2D-DMEM)，HMM培養(yǎng)7 d的HepG2細(xì)胞(HepG2-2D-HMM)形態(tài)明顯改變，表現(xiàn)為細(xì)胞增大，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)多個(gè)細(xì)胞核，胞質(zhì)內(nèi)顆粒豐富(圖1 A,B)。PAS檢測(cè)顯示HepG2-2D-HMM相對(duì)于HepG2-2D-DMEM呈明顯陽(yáng)性結(jié)果(圖1 C,D)，表明細(xì)胞合成糖原的能力明顯增強(qiáng)。

注：A. DMEM培養(yǎng)的HepG2;B.與HMM培養(yǎng)的HepG2；C. DMEM培養(yǎng)的HepG2的PAS;D. HMM培養(yǎng)的HepG2的PAS

圖1HMM培養(yǎng)HepG2前后的形態(tài)及PAS改變

對(duì)于5種主要肝細(xì)胞功能基因的QPCR顯示HMM明顯提高了HepG2的肝細(xì)胞功能基因的表達(dá)(表2)。其中，相對(duì)HepG2-2D-DMEM，HepG2-2D-HMM的主要藥物代謝酶CYP3A4表達(dá)上調(diào)4.7±0.18倍(t=18.6,P<0.01)；HBV受體NTCP表達(dá)上調(diào)1.3±0.1倍(t=8.929，P<0.01)；氨解毒及尿素循環(huán)關(guān)鍵酶CPS1表達(dá)上調(diào)4.9±0.2倍(t=19.36，P<0.01)；血漿蛋白Alb表達(dá)上調(diào)1.4±0.1倍(t=5.708，P<0.05)；糖異生關(guān)鍵酶G6PC表達(dá)上調(diào)5.6±0.1倍(t=13.14，P<0.01)。

二、HMM聯(lián)合3D培養(yǎng)提升HepG2的肝細(xì)胞功能

為了進(jìn)一步提升HepG2的肝細(xì)胞功能，建立了HMM聯(lián)合3D培養(yǎng)的HepG2培養(yǎng)體系(HepG2-3D-HMM)。懸浮在6孔低黏附板內(nèi)的單個(gè)HepG2細(xì)胞在6～12 h內(nèi)開(kāi)始聚集，并在24～48 h內(nèi)形成比較穩(wěn)定的3D結(jié)構(gòu)(圖2)，隨后繼續(xù)使用HMM培養(yǎng)7 d以提高細(xì)胞功能。尿素產(chǎn)生檢測(cè)顯示，相對(duì)于HepG2-2D-HMM，HepG2-3D-HMM的尿素合成能力大幅提升，由HepG2-2D-HMM的0.20±0.04 μg/mg protein/day提升到HepG2-3D-HMM的(88±20) μg/mg protein/day，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=4.475,P<0.05)。

圖2 HepG2-3D-HMM的顯微照片

對(duì)于5種主要肝細(xì)胞功能基因的QPCR揭示了肝細(xì)胞功能基因表達(dá)水平的進(jìn)一步提升(表2)。結(jié)果顯示，在這5種基因的表達(dá)情況中，除Alb外(t=1.024，P=0.41)，CYP3A4(t=9.176，P<0.05)、NTCP(t=30.76，P<0.01)、CPS1(t=6.371，P<0.05)、G6PC(t=64.27，P<0.01)均獲得明顯改善。

三、 HMM有利于更準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)肝毒性藥物

與3D環(huán)境下使用DMEM培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞(HepG2-3D-DMEM)相比，HepG2-3D-HMM對(duì)氯丙嗪急性肝毒性的敏感性大幅提高(圖3)。盡管HepG2-3D-HMM對(duì)氯丙嗪的TC50(85±7)μmol/L與原代肝細(xì)胞對(duì)氯丙嗪的TC50(25±5)μmol/L有一定差距(t=10.91,P<0.01)，但仍顯著優(yōu)于HepG2-3D-DMEM對(duì)氯丙嗪的TC50(254±36)μmol/L(t=7.982,P<0.01)，這表明HMM顯著改善了HepG2對(duì)于氯丙嗪毒性的預(yù)測(cè)能力。

表2 HepG2-2D-HMM及HepG2-3D-HMM相對(duì)HepG2-2D-DMEM的肝功能基因表達(dá)量

注：與HepG2-2D-DMEM相比，at=18.6,bt=8.929,ct=5.708,dt=19.36,et=13.14； 均P<0.05。與HepG2-2D-HMM相比，ft=9.176,gt=30.76,ht=1.024,it=6.371,jt=64.27; 除hP=0.41外, 余均P<0.05

討 論

肝細(xì)胞廣泛用于多種領(lǐng)域，然而，原代人肝細(xì)胞的諸多缺陷嚴(yán)重限制了其應(yīng)用。作為目前使用最廣泛的永生肝細(xì)胞模型之一，HepG2肝癌細(xì)胞系已用于藥物誘導(dǎo)的肝毒性評(píng)估[1]。然而，HepG2細(xì)胞系的藥物代謝基因表達(dá)水平低下[1]。為了克服這個(gè)缺點(diǎn)，我們開(kāi)發(fā)了一種肝細(xì)胞成熟培養(yǎng)基(HMM)，前期工作表明，HMM可以快速將肝細(xì)胞來(lái)源的肝祖細(xì)胞樣細(xì)胞(HepLPCs)分化成成熟的肝細(xì)胞[5, 6]。在本研究中，HMM被證明能夠快速誘導(dǎo)HepG2的功能提升。與DMEM培養(yǎng)的HepG2相比，HMM培養(yǎng)的HepG2一方面表現(xiàn)出更接近成熟肝細(xì)胞的形態(tài)、更強(qiáng)的糖原合成能力，另一方面其多個(gè)肝細(xì)胞基因表達(dá)水平，特別是代謝了超過(guò)1/3的藥物的CYP3A4的基因表達(dá)水平，同樣得到顯著提升。這無(wú)疑會(huì)在一定程度上緩解HepG2較低的肝細(xì)胞功能帶來(lái)的影響。

越來(lái)越多的證據(jù)表明，在3D環(huán)境中培養(yǎng)細(xì)胞可以顯著改善其肝功能[7，8]，盡可能的模擬體內(nèi)肝臟復(fù)雜性一直被認(rèn)為是再生醫(yī)學(xué)，藥物開(kāi)發(fā)和生物技術(shù)領(lǐng)域的主要挑戰(zhàn)[9]。本研究聯(lián)合3D培養(yǎng)及HMM誘導(dǎo)，建立了HepG2-3D-HMM模型。所得的HepG2-3D-HMM，相對(duì)于HepG2-2D-HMM，多個(gè)肝細(xì)胞基因表達(dá)水平明顯得到提高。為了進(jìn)一步驗(yàn)證HMM在HepG2的3D培養(yǎng)物中的重要作用，對(duì)比了HepG2-3D-HMM以及HepG2-3D-DMEM對(duì)已知肝毒性藥物氯丙嗪的48 h急性肝毒性的預(yù)測(cè)能力，結(jié)果顯示，HMM顯著改善了HepG2的3D培養(yǎng)物對(duì)氯丙嗪肝毒性的敏感性，其TC50更接近于文獻(xiàn)報(bào)道的原代人肝細(xì)胞的TC50，因此HMM聯(lián)合3D培養(yǎng)將極大的促進(jìn)HepG2在制藥工業(yè)中的應(yīng)用并減少藥物誘導(dǎo)肝損傷的發(fā)生率。除此之外，相對(duì)于HepG2-2D-HMM，HepG2-3D-HMM尿素合成能力的大幅提升，已經(jīng)超過(guò)了文獻(xiàn)中報(bào)道的幾種生物人工肝常用細(xì)胞的尿素合成能力[10]。這說(shuō)明其在生物人工肝方面應(yīng)用的潛力。

綜合上述，聯(lián)合3D培養(yǎng)，所培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞功能會(huì)進(jìn)一步提升，使其更適于藥物肝毒性篩查甚至是生物人工肝的建立。