何啟軍 符火 陳揚(yáng) 許海霞

自身免疫性肝炎(Autoimmune hepatitis，AIH)主要由異常自身免疫反應(yīng)介導(dǎo)，與性別、年齡、病毒、遺傳等因素有關(guān)，但詳細(xì)機(jī)制并不明確[1]。有資料顯示，肝組織中程序性死亡受體1(Programmed death 1，PD-1)經(jīng)調(diào)節(jié)T細(xì)胞分化和活化抑制傳導(dǎo)信號(hào)，對(duì)免疫細(xì)胞功能發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用，與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥等免疫性疾病有關(guān)，并在原發(fā)性膽汁性膽管炎、AIH、慢性丙型肝炎患者肝內(nèi)表達(dá)明顯，推測(cè)自身免疫性肝病的發(fā)生與PD-1密切相關(guān)[2]。本研究納入60例AIH患者進(jìn)行系統(tǒng)分析，旨在探討PD-1與AIH炎性反應(yīng)的關(guān)系。

資料與方法

一、 一般資料

納入?？卺t(yī)院2015年11月至2018年11月收治的AIH患者60例，男12例，女48例，年齡18～65歲，平均(47.1±12.1)歲。另選同期60例健康體檢者為健康對(duì)照組，其中男14例，女46例，年齡18～67歲，平均(48.2±12.1)歲。按疾病活動(dòng)程度，將60例患者分為AIH緩解期組18例，AIH活動(dòng)期組42例。研究對(duì)象均簽署知情同意書，獲醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①參考《自身免疫性肝病診斷和治療指南》[3]中AIH診斷標(biāo)準(zhǔn)，免疫球蛋白G或γ-球蛋白或總血清球蛋白濃度為正常上限1.5倍以上；血清天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶異常；血清抗體檢測(cè)示平滑肌及血清抗核抗體或抗肝/腎微粒體抗體1型抗體滴度為1∶80以上；HAV和HBV陰性，肝組織學(xué)示界面性肝炎中或重度；②入組前30 d內(nèi)無肝毒性藥物服用史；③年齡≥18歲，首次發(fā)病，且為Ⅰ型AIH。排除標(biāo)準(zhǔn)：①嚴(yán)重心腦血管疾病及消化、呼吸系統(tǒng)疾病；②藥物性、遺傳代謝性、酒精性肝病等所致肝功能異常者；③合并肝性腦病、重疊綜合征，或其他感染性疾??；④入組前3個(gè)月內(nèi)服用糖皮質(zhì)激素、甲氨蝶呤等；⑤精神疾患；⑥白細(xì)胞減少<2.5×109/L；⑦妊娠或哺乳期婦女。

二、肝組織PD-1檢測(cè)

1.主要儀器與試劑：LH50A 型倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)、DHP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)、MNl620型巴德一次性全自動(dòng)活檢槍(美國巴德公司)、HPIAS-1000高清晰彩色病理圖文分析系統(tǒng)(武漢清平影像技術(shù)有限責(zé)任公司)。兔抗人PD-1抗體(英國Abcam公司)、二抗試劑盒SP-9001(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑盒購自英國Abcam公司。

2.標(biāo)本處理：采用巴德一次性全自動(dòng)活檢槍，抽吸出索狀肝組織(長約20 mm)，匯管區(qū)為8個(gè)及以上，4%甲醛固定24 h，石蠟包埋后連續(xù)切片(厚度約4 μm)，予以標(biāo)記。通過烤片、脫水、封閉內(nèi)源性過氧化物酶、抗原修復(fù)、滴加一抗、二抗及孵育、復(fù)染等處理后，高倍鏡下觀察20個(gè)視野，行免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定。由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師采用雙盲法閱片。

3.PD-1檢測(cè)：采用免疫組織化學(xué)卵白素-生物素-酶復(fù)合物染色法進(jìn)行PD-1檢測(cè)，表達(dá)工作濃度1∶200，通過3%雙氧水作用、抗原修復(fù)后，加入兔抗人PD-1抗體，4℃培養(yǎng)過夜，第2天清晨加入第二抗體，行顯色、復(fù)染等處理。以PD-1陽性切片為陽性對(duì)照，并以磷酸鹽緩沖液代替一抗為陰性對(duì)照。陽性判定：肝細(xì)胞包膜和胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒。

4.圖像分析：采用HPIAS-1000高清晰彩色病理圖文分析系統(tǒng)，每張切片取高倍視野5個(gè)，檢測(cè)肝組織PD-1平均吸光度值、積分吸光度值，測(cè)量5個(gè)視野均值。

三、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè)

清晨空腹采血3 mL，離心后取上層血清，運(yùn)用uniceL DxC800型全自動(dòng)生化分析儀，總膽紅素試劑盒購自寧波普瑞柏生物技術(shù)股份有限公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，試劑盒購自上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司；采用免疫比濁法檢測(cè)免疫球蛋白A、G、M，試劑盒均購自美康生物科技股份有限公司。

四、觀察指標(biāo)

統(tǒng)計(jì)緩解期組與活動(dòng)期組一般資料，觀察各組PD-1陽性表達(dá)率，分析PD-1表達(dá)與肝臟炎性反應(yīng)的關(guān)系，并探討PD-1表達(dá)與總膽紅素、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的相關(guān)性。肝組織炎性反應(yīng)判定[4]：按標(biāo)本組織中肝細(xì)胞變性、壞死、炎性細(xì)胞浸潤程度、匯管區(qū)纖維增生、纖維分隔形成病理改變狀況，進(jìn)行肝組織炎癥活動(dòng)度(G)分級(jí)，包括G0～G4級(jí)，其中無炎癥：G0級(jí)；輕度炎癥：G1～G2級(jí)；重度炎癥：G3～G4級(jí)。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、AIH緩解期與活動(dòng)期組基線資料比較

AIH緩解期組總膽紅素、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、免疫球蛋白G顯著低于AIH活動(dòng)期組(P<0.05)，其他指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

二、 各組研究對(duì)象PD-1陽性表達(dá)率比較

AIH組PD-1陽性表達(dá)率為(13.58±6.82)%，顯著高于健康對(duì)照組的(2.23±0.67)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.829，P<0.01)。AIH活動(dòng)期患者肝組織病理學(xué)改變多表現(xiàn)為界面性肝炎，伴匯管區(qū)炎性細(xì)胞(單核細(xì)胞、漿細(xì)胞、淋巴細(xì)胞)浸潤，多數(shù)肝小葉內(nèi)見碎屑樣或點(diǎn)狀壞死，匯管區(qū)炎癥未侵犯膽管系統(tǒng)，PD-1陽性表達(dá)率為(16.52±7.70)%。AIH緩解期組未發(fā)現(xiàn)界面性肝炎，匯管區(qū)無漿細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤及壞死，PD-1陽性表達(dá)率為(6.54±3.14)%。AIH活動(dòng)期組PD-1陽性表達(dá)率顯著高于AIH緩解期組及健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.293、7.823，均P<0.01)，見圖1。

三、 PD-l與肝臟炎癥的關(guān)系

60例AIH患者中，肝組織炎癥活動(dòng)度G0級(jí)18例、G1～G2級(jí)23例、G3～G4級(jí)19例，PD-1陽性表達(dá)率依次為(6.57±3.14)%、(14.30±5.05)%、(19.24±5.46)%。其中，G0級(jí)AIH患者PD-1陽性表達(dá)率顯著低于G1～G2級(jí)、G3～G4級(jí)(t=5.683、8.588，均P<0.01)，G1～G2級(jí)AIH患者PD-1陽性表達(dá)率顯著低于G3～G4級(jí)(t=3.042，P=0.004)，見圖2。

四、 PD-1與總膽紅素、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的相關(guān)性

直線相關(guān)分析顯示，PD-1表達(dá)與總膽紅素、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶呈正相關(guān)(r=0.853、0.863、0.884，均P<0.01)，見圖3～5。

討 論

本研究結(jié)果顯示，肝炎組PD-1陽性表達(dá)率明顯高于健康對(duì)照組，而理論上AIH患者PD-1陽性表達(dá)率應(yīng)明顯下降，可能是機(jī)體為了應(yīng)對(duì)自身免疫反應(yīng)而產(chǎn)生的一種代償機(jī)制，但PD-1上調(diào)并不能控制疾病發(fā)生及發(fā)展?？吕び頪5]等也發(fā)現(xiàn)，AIH 患者肝組織PD-1表達(dá)明顯高于健康對(duì)照組，提示其可能參與AIH的發(fā)病。此外，AIH活動(dòng)期組PD-1陽性表達(dá)率明顯高于AIH緩解期組，間接說明肝內(nèi)浸潤性T淋巴細(xì)胞已激活，發(fā)揮生物學(xué)功能，證實(shí)免疫抑制劑(如硫唑嘌呤、糖皮質(zhì)激素等)可能經(jīng)抑制T細(xì)胞活化，降低PD-1表達(dá)。有資料顯示，表達(dá)PD-1的T、B細(xì)胞與其配體PD-L陽性細(xì)胞相互作用，能促使B、T細(xì)胞免疫效應(yīng)下降，引起自身反應(yīng)性淋巴結(jié)細(xì)胞功能受抑，進(jìn)而預(yù)防外周組織被自身免疫攻擊，證實(shí)其參與炎癥病理發(fā)生、發(fā)展過程[6]。這可能是在共刺激通路中，PD-1/PD-L信號(hào)通路出現(xiàn)功能障礙，或正性刺激信號(hào)過強(qiáng)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于負(fù)性抑制信號(hào)抑制免疫反應(yīng)作用，引起機(jī)體免疫耐受紊亂，導(dǎo)致其無法實(shí)現(xiàn)免疫反應(yīng)抑制性調(diào)控作用，最終誘導(dǎo)疾病發(fā)生。

表1 AIH緩解期組與活動(dòng)期組基線資料比較

圖1 各組患者肝組織中PD-1表達(dá) A.健康對(duì)照組；B.AIH緩解期；C.AIH活動(dòng)期

圖2 AIH患者肝組織中PD-1表達(dá) A.G0級(jí)AIH患者；B.G1～G2級(jí)AIH患者；C.G3～G4級(jí)AIH患者

圖3 PD-1與總膽紅素的線性相關(guān)圖

圖4 PD-1與天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的線性相關(guān)圖

圖5 PD-1與丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的線性相關(guān)圖

本研究發(fā)現(xiàn)，G0級(jí)AIH患者PD-1陽性表達(dá)率明顯低于G1～G2級(jí)及G3～G4級(jí)，且G1～G2級(jí)AIH患者PD-1陽性表達(dá)率明顯低于G3～G4級(jí)，與熊克宮等[7]報(bào)道相似，提示隨著肝組織炎癥活動(dòng)的逐漸加重，患者PD-1陽性表達(dá)率呈明顯上升趨勢(shì)，證實(shí)PD-1與AIH炎性反應(yīng)有關(guān)。另外，本研究結(jié)果顯示，PD-1表達(dá)與總膽紅素、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶呈正相關(guān)，提示PD-1與肝臟炎癥活動(dòng)程度有關(guān)。Darb-Esfahani等[8]也發(fā)現(xiàn)，AIH患者肝組織PD-1呈高表達(dá)，與纖維化分級(jí)無明顯關(guān)聯(lián)，但與肝組織炎癥活動(dòng)度有關(guān)，表明PD-1參與AIH炎癥發(fā)生、發(fā)展。筆者認(rèn)為，PD-1與肝臟炎癥活動(dòng)有關(guān)，可能是肝臟炎性反應(yīng)加重時(shí)機(jī)體的一種自我保護(hù)機(jī)制。具體而言，肝臟存在明顯免疫介導(dǎo)的炎性反應(yīng)活動(dòng)時(shí)，機(jī)體免疫反應(yīng)強(qiáng)，為預(yù)防肝組織損傷，機(jī)體PD-1呈高表達(dá)，抑制T細(xì)胞活性，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答下降，證實(shí)肝組織PD-1表達(dá)與病情慢性化進(jìn)展相關(guān)。而PD-1/PD-L信號(hào)通路是AIH免疫逃逸的關(guān)鍵機(jī)制，在AIH發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，早期檢測(cè)PD-1利于評(píng)估肝臟病理程度。

綜上，AIH患者PD-1與肝臟炎性反應(yīng)密切相關(guān)，臨床上應(yīng)引起足夠重視。但本文樣本量較少，干預(yù)時(shí)間較短，所得結(jié)論可能存在一定偏差。Zou等[9]報(bào)道，部分肝癌患者肝組織中PD-1表達(dá)上調(diào)，其預(yù)后比PD-1低表達(dá)者差，提示PD-1對(duì)腫瘤預(yù)后有一定作用。本文未涉及PD-1與AIH患者預(yù)后的關(guān)系，有待今后開展多中心、大樣本的隨機(jī)對(duì)照實(shí)驗(yàn)，以深入探索其機(jī)制。