徐國翔

（深圳市坪山區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，廣東深圳 518118）

豬瘟是一種烈性傳染病，具有高致死性，豬瘟病毒（CSFV）是其主要引發(fā)因素，病豬通常會有出血或母豬流產(chǎn)等特征出現(xiàn)。該病傳播速度較快，致死率偏高，在傳播過程中通常借助呼吸道、消化道，世界動物衛(wèi)生組織在必須報告的傳染病中對豬瘟進(jìn)行了明確規(guī)定。因該病對我國養(yǎng)豬業(yè)所造成的危害十分嚴(yán)重，故而農(nóng)業(yè)部也在動物疫病中納入了該病。

實時熒光RT-PCR是上世紀(jì)90年代發(fā)展起來的一種能夠準(zhǔn)確定量核酸分子的新技術(shù)，其主要優(yōu)點是可以對DNA以及機(jī)體mRNA表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，因此很快應(yīng)用于病毒學(xué)研究[1]，為對豬瘟病毒進(jìn)行檢測，本文通過反復(fù)檢測試驗，成功建立了特異性豬瘟病毒實時熒光RT-PCR檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株和樣品

豬瘟病毒（CSFV）、豬O型口蹄疫病毒（O-FMDV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型（PCV2）、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬細(xì)小病毒（PPV）的滅活疫苗，購自中牧實業(yè)公司，通過多次凍融后用于RNA/DNA提取。

1.1.2 儀器設(shè)備與主要試劑

磁珠法全自動核酸提取試劑盒；MagMAXTMExpress核酸提取儀；世紀(jì)元亨豬瘟通用型實時熒光RT-PCR試劑盒；ABI7500實時熒光定量PCR儀。

1.2 方法

1.2.1 模板制備

借助MagMAXTMExpress核酸提取儀，以磁珠法全自動核酸提取試劑盒說明書為根據(jù)分別對PPV、PRV、PCV2的DNA和O-FMDV、PRRSV、CSFV的RNA進(jìn)行提取。將提取的DNA/RNA用于PCR擴(kuò)增或儲存于-20℃處，備用。

1.2.2 精密度試驗

將同一瓶CSFV疫苗分成6份進(jìn)行RNA提取，并以此作模板進(jìn)行試驗。X軸為CT值，Y軸選用Rn，進(jìn)行CSFV實時熒光定量PCR方法精密性驗證。

1.2.3 準(zhǔn)確度試驗

設(shè)計一組樣品，這一組樣品中含有豬瘟病毒的樣品和不含有豬瘟病毒的樣品都需包括，并送到具備豬瘟病毒實時熒光RTPCR檢測能力的實驗室進(jìn)行對比檢測。

1.2.4 特異性試驗

以選中的反應(yīng)體系、條件為參考，擴(kuò)增制備于1.2.1中的PPV、PRV、PCV2的DNA和O-FMDV、PRRSV、CSFV的RNA，并設(shè)置陰性對照和陽性對照。

2 結(jié)果

2.1 精密度試驗

精密度檢測結(jié)果（見圖1）：6次檢測CT值分別為23.2、23.4、23.3、23.7、23.6、22.9，變異系數(shù)為1.10%。

圖1

2.2 準(zhǔn)確度試驗

對設(shè)計的一組樣品進(jìn)行對比檢測，檢測結(jié)果一致，因此該方法檢測CSFV具有良好的準(zhǔn)確度。

2.3 特異性試驗

借助本文所制定的方法擴(kuò)增含的CSFV的疫苗，會有陽性擴(kuò)增信號出現(xiàn)，而PPV、PRV、PCV2、O-FMDV、PRRSV的核酸模板并未有陽性擴(kuò)增出現(xiàn)（見圖2），說明本方法具有良好的特異性。

圖2

3 討論

對于中國養(yǎng)豬業(yè)而言，CSFV所造成的危害十分嚴(yán)重。當(dāng)前，我國擁有眾多豬瘟疫苗生產(chǎn)企業(yè)，但是所生產(chǎn)的疫苗質(zhì)量之間差異十分明顯，時常出現(xiàn)失敗的免疫，再加上CSFV臨床表現(xiàn)十分復(fù)雜，缺乏典型性病例，僅靠臨床癥狀幾乎無法確診?？焖?、特異、敏感的分子生物學(xué)診斷方法的研發(fā)有利于CSFV的快速檢測[2]、CSFV病原陽性豬的淘汰及凈化豬群豬瘟。

該方法采用提取樣品中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可檢測多種樣品陽性豬瘟病毒，而特異性擴(kuò)增并未在其它不含CSFV的樣品中出現(xiàn)，準(zhǔn)確度和精密度試驗結(jié)果也成立，這表明了該方法具有較為良好的特異性、精密度和準(zhǔn)確度。

綜上所述，本文所提出的CSFV實時熒光定量PCR檢測方法具備快速、特異、準(zhǔn)確等特點，故而在CSFV快速檢測中十分適用。