顏超躍 艾夢燕 湯 承

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都 610225）

Nebovirus（NeV）是杯狀病毒科（Caliciviridae family）紐布病毒屬（Nebovirus genus）唯一成員（https：//talk.ictvonline.org/）。NeV為單股正鏈RNA病毒，是致犢牛腹瀉的病毒[1-4]。根據(jù)RdRp基因序列，NeV可以分為2種基因型（NB-like和NA1-like）；根據(jù)完整VP1序列，NeV可以分為2種基因型（基因1型和基因2型），其中基因1型又細(xì)分為4個譜系（譜系1～4）[5]。迄今為止，NeV已經(jīng)在美國、英國、巴西、土耳其、日本等12個國家檢出，具有廣泛的地域分布[6-16]。最近本實驗室首次證實NeV在國內(nèi)的存在，并在國內(nèi)奶牛中廣泛流行[17，18]。

NeV基因全長7，453～7，454 bp，分為2個ORFs[19]。ORF-1的長度為2，210個氨基酸（aa），依次編碼P34、NTPase、P30、VPg、3CLpro、RdRp和VP1蛋白[20]。ORF-2的長度為225 aa，編碼次要衣殼蛋白（VP2）[2]。NeV的VP1基因的核苷酸長度為1，650 bp，編碼549個氨基酸（aa）。NeV VP1是重要的結(jié)構(gòu)蛋白，參與病毒與組織血型抗原（HBGAs）的結(jié)合[21]。此外，其它杯狀病毒的VP1被證實具有宿主特異性、抗原性和免疫原性[22-24]。NeV VP1由P結(jié)構(gòu)域和S結(jié)構(gòu)域組成[25]。P結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步分為兩個子結(jié)構(gòu)域，P1和P2。其中高度突變的P2結(jié)構(gòu)域含有受體結(jié)合位點，負(fù)責(zé)宿主特異性和毒株多樣性[26]。

本次研究旨在進(jìn)一步了解國內(nèi)牛NeV VP1分子的特征，為NeV的防控和疫苗的制備提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

2018年10月，從遼寧某牧場采集20份奶牛腹瀉樣本于-80℃保存。

1.2 主要試劑與儀器

TRIzolTMReagent、PrimeScriptTMRT reagent Kit、pMDTM19-T Vector均購于TaKaRa公司；感受態(tài)細(xì)胞DH5ɑ、Cycle-pure Kit、Gel Extraction Kit均購于大連寶生物工程股份有限公司。高速冷凍離心機(jī)5810R（德國Eppendorf）；普通梯度PCR儀（美國BIORAD）；凝膠成像分析系統(tǒng)5200Multi（中國天能）；電泳電源EPS300（中國天能）。

1.3 RNA的提取及cDNA的合成

將腹瀉糞便樣本與PBS按照1：5（W：V）的比例重懸混合，5000 r/min離心4 min，取400 μl上清液于1.5 ml的Ep管中，按照TRIzolTMReagent的說明書提取總RNA，并按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.4 NeV的檢測

NeV的檢測采用國外文獻(xiàn)報道的巢式RT-PCR方法[24]。

1.5 完整的VP1基因的克隆

根據(jù)GenBank中的NeV的完整VP1基因序列，利用Primer 5.0和DnaSP軟件設(shè)計包含重疊區(qū)域的4對引物，分段擴(kuò)增的NeV完整VP1基因，引物均由生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物信息見表1。

優(yōu)化的25μl反應(yīng)體系：EmeraldAmp PCR Master Mix（2×Premix）10 μL，上、下游引物各1.0 μl，模板1.5 μl，用ddH2O補(bǔ)齊到25 μl。反應(yīng)條件為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s、53 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共35循環(huán)，72℃ 5 min。純化PCR產(chǎn)物，連接至pMDTM19-T載體，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞DH5ɑ，篩選陽性克隆接入含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)8 h后送生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.6 VP1序列的拼接及遺傳進(jìn)化分析

利用DNASTAR EditSeq和Seqman軟件將VP1上各片段進(jìn)行剪輯拼接，獲得完整的VP1基因序列。用MegAlign軟件進(jìn)行相似性分析，用MEGA 5.2軟件的最大似然法構(gòu)建進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 腹瀉糞便樣本中NeV檢測結(jié)果

從20份腹瀉奶牛糞便樣本中檢測出13份NeV陽性樣本，檢出率為65.0%。PCR產(chǎn)物的凝膠電泳圖見圖1，條帶與預(yù)期大小一致。

圖1 NeV巢式PCR檢測結(jié)果

2.2 NeV VP1基因的序列及遺傳進(jìn)化分析

成功得到3個NeV完整VP1基因序列，毒株名為Bo/HS-2/19/CH、Bo/HS-6/19/CH、Bo/HS-10/19/CH。本次實驗得到的3個完整的NeV VP1基因序列之間的核苷酸和氨基酸相似性分別為99.3%～99.8%和99.1%～99.6%，與GenBank中登錄的NeV VP1基因核苷酸和氨基酸相似性分別為82.3%～95.6%和92.3%～98.9%，與國內(nèi)NeV VP1基因核苷酸、氨基酸相似性都表現(xiàn)為最高，分別達(dá)94.2%～95.6%、96.2%～98.9%。NeV VP1基因序列的氨基酸遺傳進(jìn)化樹顯示，本實驗獲得的Bo/HS-2/19/CH、Bo/HS-6/19/CH、Bo/HS-10/19/CH株在進(jìn)化樹上單獨聚于一支，均為基因1型的譜系1毒株，與國內(nèi)的遼寧、河南、四川、山東NeV毒株的遺傳關(guān)系最近，但是有一定的遺傳距離（圖2）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，Bo/HS-2/19/CH與其他所有NeV相比，表現(xiàn)為在53位處的氨基酸由A→T，211位的氨基酸由N→S。Bo/HS-2/19/CH、Bo/HS-6/19/CH、Bo/HS-10/19/CH株與其他所有NeV相比，表現(xiàn)為在291位的氨基酸由R→H。

表1 擴(kuò)增NeV VP1完整基因的引物信息

3 討論

與全球趨勢一致，腹瀉作為是我國犢牛最常見的疾病之一，其導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[27]。NeV作為一個重要的致犢牛腹瀉的病毒[28]，本實驗室已經(jīng)證實該病毒在我國存在并廣泛流行[17，18]。本研究對一個牧場的奶牛腹瀉樣本進(jìn)行分子檢測，檢出率為65.0%。高檢出率表明該病毒可能是這個牧場的重要的腹瀉病毒，這對該牧場奶牛腹瀉疾病的防控提供參考。

遺傳進(jìn)化樹表明，本次實驗獲得的Bo/HS-2/19/CH、Bo/HS-6/19/CH、Bo/HS-10/19/CH株在進(jìn)化樹上單獨聚于一支，均為基因型的譜系1毒株，與國內(nèi)NeV毒株的遺傳關(guān)系最近，但是有一定的遺傳距離。VP1是NeV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，參與病毒與HBGAs的結(jié)合[21]。此外，其它杯狀病毒的VP1被證實具有宿主特異性和免疫原性[22，23，29]。本研究Bo/HS-2/19/CH在53位的氨基酸由A→T，21位的氨基酸由N→S和高變的P2結(jié)構(gòu)域的291位氨基酸由R→H，這3個氨基酸的突變對其VP1功能影響有待于進(jìn)一步研究[30，31]。

圖2 基于NeV VP1基因氨基酸序列的最大似然法進(jìn)化樹

4 結(jié)論

從2018年10月采自遼寧省20份奶牛腹瀉糞便樣本中檢測出13份NeV陽性樣本，檢出率為65.0%。成功獲得3條NeV完整VP1基因序列，遺傳進(jìn)化表明均為基因1型的譜系1毒株，豐富了國內(nèi)牛NeV VP1基因信息，也為該牛場犢牛腹瀉的防控提供了參考。