劉付鋒，張亞偉，孫遠(yuǎn)遠(yuǎn)，陳景景，宋早智，劉號(hào)峰，劉永紅，趙士弟，金功圣

(1蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，安徽蚌埠233000；2福建醫(yī)科大學(xué)附屬軍區(qū)總醫(yī)院；3杭州市臨安區(qū)第一人民醫(yī)院；4杭州市余杭區(qū)第一人民醫(yī)院)

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤[1]，主要治療策略是手術(shù)和輔助化療。由于難以設(shè)計(jì)個(gè)體化治療，乳腺癌患者的臨床管理也是一個(gè)巨大挑戰(zhàn)，耐藥性和劑量限制性毒性都可能影響治療效果和預(yù)后。因此，迫切需要開發(fā)新的、不良反應(yīng)更小的藥物來改善患者的生存質(zhì)量。天然藥物因其低毒性和高生物活性被廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)研究[2]。土貝母苷甲是從中藥南蛇藤(葫蘆科)塊莖中分離得到的一種天然化合物。據(jù)報(bào)道其有廣泛的生物學(xué)作用，包括抗炎、抗病毒、免疫抑制等[3]。越來越多的證據(jù)表明，土貝母苷甲具有顯著的抗腫瘤作用，可抑制細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期，促進(jìn)人食管鱗癌(KYSE520)、絨毛膜癌(JEG-3)、肺癌(NCI-H292)及鼻咽癌(CNE-2Z)細(xì)胞自噬[4]，有望成為一種新的抗癌藥物成分。然而，土貝母苷甲對人乳腺癌細(xì)胞的作用仍不清楚。因此，本研究觀察了土貝母苷甲對人三陰性乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231增殖、凋亡、自噬的影響，并探討其潛在的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要材料 人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231購自中科院上海細(xì)胞庫，加入含10%胎牛血清、5%青霉素的DMEM高糖溶液，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。土貝母苷甲標(biāo)準(zhǔn)品購于大連美侖科技有限公司，純度>98%，使用DMEM培養(yǎng)液溶解成100 μg/mL儲(chǔ)存液，于-20 ℃避光保存。胎牛血清購自德國Clark公司。DMEM高糖培養(yǎng)液購自美國Hyclone公司。CCK-8試劑盒、Annexin v-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、Western blotting所用配膠試劑盒、蛋白測定試劑盒均購自碧云天生物科技公司。受體相互作用蛋白激酶1(RIP1)、自噬標(biāo)志物L(fēng)C3、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶(Akt)B和磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)一抗及羊抗兔二抗均購自美國CST公司。帶熒光標(biāo)記的熒光二抗為博士德公司產(chǎn)品。自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)購自大連美侖生物科技公司。

1.2 土貝母苷甲對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響觀察 將含100 μg/mL土貝母苷甲的DMEM儲(chǔ)存液稀釋成5、10、15、20、25、30 μg/mL。96孔板中細(xì)胞生長密度達(dá)到80%時(shí)，進(jìn)行加藥處理。設(shè)置調(diào)零孔(只加培養(yǎng)液)、對照孔(不加藥物)及5、10、15、20、25、30 μg/mL土貝母苷甲孔，每組5個(gè)復(fù)孔。待給藥48 h后，棄去含土貝母苷甲的MDEM培養(yǎng)液。每孔加入10 μL的CCK-8溶液，置于37 ℃搖床下孵育1 h。酶標(biāo)儀上檢測450 nm波長下的OD值。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)孔OD值-調(diào)零孔OD值)/(對照孔OD值-調(diào)零孔OD值)×100%。

1.3 土貝母苷甲對乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響觀察

1.3.1 細(xì)胞凋亡率測算 將乳腺癌細(xì)胞接種于6孔板，當(dāng)細(xì)胞生長密度達(dá)到80%時(shí)，分為對照組和5、10、20 μg/mL土貝母苷甲組。給藥48 h后，消化、離心，收集6孔板中的細(xì)胞到15 mL離心管中，加入適量PBS重懸細(xì)胞2次。將重懸后的細(xì)胞移到流式管中，每管加入500 μL的結(jié)合液(Binding buffer)。充分混勻后依次加入5 μL的Annexin V-FITC及5 μL的PI染色液。在半小時(shí)內(nèi)完成上機(jī)檢測，F(xiàn)low J軟件分析并計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.3.2 細(xì)胞凋亡類型分析 選取生長狀態(tài)好的兩瓶MDA-MB-231細(xì)胞，一瓶不進(jìn)行特殊處理，另一瓶加入含有20 μg/mL土貝母苷甲的DMEM溶液，處理24 h。收集細(xì)胞，12 000 r/min離心10 min，去上清液，預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞沉淀3次。加入1 mL的2.5%戊二醛固定液，在電子透射顯微鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)并拍照。

1.4 土貝母苷甲對乳腺癌細(xì)胞自噬、凋亡及PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響觀察 細(xì)胞分組處理參照“1.3.1”。采用Western blotting法檢測各組細(xì)胞中的自噬相關(guān)蛋白LC3、凋亡相關(guān)蛋白R(shí)IP1、PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白PI3K、Akt、p-Akt、P62和p-mTOR。用裂解液裂解各組細(xì)胞總蛋白；蛋白定量后行SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜；RIP1、LC3、PI3K、p-Akt、p-mTOR一抗4 ℃孵育過夜后加入羊抗兔二抗，37 ℃孵育1 h；凝膠成像系統(tǒng)ECL成像；用Image J軟件分析各組條帶灰度值，目的蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參GAPDH灰度值。

1.5 3-MA對土貝母苷甲誘導(dǎo)自噬的影響觀察 將乳腺癌細(xì)胞分為對照組、3-MA組、土貝母苷甲組、土貝母苷甲+3-MA組。對照組不加入藥物，3-MA組加入10 mmol/L的3-MA，土貝母苷甲組加入20 μg/mL的土貝母苷甲，土貝母苷甲+3-MA組加入10 mmol/L的3-MA和20 μg/mL的土貝母苷甲。各組培養(yǎng)24 h后，提取細(xì)胞總蛋白，采用Western blotting法檢測細(xì)胞中的LC3、p-Akt蛋白。

2 結(jié)果

2.1 土貝母苷甲對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響 對照組及5、10、15、20、25、30 μg/mL土貝母苷甲組細(xì)胞存活率分別為100.0%±0.7%、93.7%±2.2%、88.6%±2.7%、82.3%±4.7%、64.9%±3.8%、43.4%±5.3%、23.8%±3.7%，各組細(xì)胞存活率依次下降(P均<0.01)。

2.2 土貝母苷甲對乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響 對照組及5、10、20 μg/mL土貝母苷甲組細(xì)胞凋亡率分別為5.3%±0.7%、9.8%±1.8%、17.8%±3.4%、37.9%±3.1%，各組細(xì)胞凋亡率依次增高(P均<0.05)。透射電子顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)形成吞噬泡，大量單層膜構(gòu)成的自噬體和自噬溶酶體顯著蓄積；高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器膨脹；胞質(zhì)無定形，核碎斷、固縮；可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)包圍將要被吞噬的底物，隨后與初級(jí)溶酶體結(jié)合形成囊泡，可見細(xì)胞膜出泡現(xiàn)象。

2.3 土貝母苷甲對乳腺癌細(xì)胞自噬、凋亡、PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 對照組及5、10、20 μg/mL土貝母苷甲組細(xì)胞中RIP1、LC3蛋白相對表達(dá)量依次增加(P均<0.01)，PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白相對表達(dá)量依次降低(P均<0.05)。見表1。

表1 兩組乳腺癌細(xì)胞中LC3、RIP1、PI3K、Akt、p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)比較

注：與對照組相比，*P<0.05;與5 μg/mL土貝母苷甲組相比，#P<0.05;與10 μg/mL土貝母苷甲組相比，△P<0.05。

2.4 3-MA對土貝母苷甲誘導(dǎo)自噬的影響 對照組、3-MA組、土貝母苷甲組、土貝母苷甲+3-MA組的LC3蛋白相對表達(dá)量分別為1.02±0.07、0.93±0.06、1.49±0.16、1.22±0.07，土貝母苷甲+3-MA組LC3蛋白表達(dá)低于土貝母苷甲組(P<0.05)；p-Akt蛋白相對表達(dá)量分別為1.04±0.02、1.65±0.09、0.68±0.14、0.84±0.11，3-MA組、土貝母苷甲+3-MA組p-Akt蛋白表達(dá)高于土貝母苷甲組(P均<0.05)。

3 討論

自然界中存在許多具有生物活性的三萜皂苷類化合物。多項(xiàng)研究表明，皂甙化合物通過調(diào)節(jié)凋亡、自噬等抑制腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成及轉(zhuǎn)移[5]。皂甙化合物可靶向作用于腫瘤的多種信號(hào)通路，顯示出潛在的抗腫瘤特性[6]。許多皂苷合成的化合物如柴胡、人參、三七、甘草和黃芪等已經(jīng)在臨床中使用，并且有極大的前景[7]。本研究將皂苷類提取物土貝母苷甲作用于人三陰性乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231，發(fā)現(xiàn)隨著土貝母苷甲作用濃度增高，乳腺癌細(xì)胞存活率下降、凋亡率增高，提示土貝母苷甲可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖并促使其凋亡，作用呈劑量依賴性。

細(xì)胞凋亡是由抗癌化療藥物誘發(fā)的一種重要的細(xì)胞死亡過程，其特征是細(xì)胞皺縮、細(xì)胞核破裂和凋亡小體形成。RIP1是構(gòu)成凋亡小體的核心成分[8]。本研究結(jié)果顯示，隨著土貝母苷甲作用濃度升高，凋亡關(guān)鍵蛋白R(shí)IP1表達(dá)增加，提示土貝母苷甲誘導(dǎo)了RIP1依賴性的細(xì)胞凋亡。為了分析土貝母苷甲誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的類型，本課題組進(jìn)行了細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察，發(fā)現(xiàn)MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)形成吞噬泡，大量單層膜構(gòu)成的自噬體和自噬溶酶體顯著蓄積，高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器膨脹，胞質(zhì)無定形，核碎裂、固縮，可見細(xì)胞膜出泡現(xiàn)象，上述結(jié)果表明土貝母苷甲誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞發(fā)生了自噬。

細(xì)胞自噬又稱為Ⅱ型細(xì)胞死亡，是細(xì)胞在自噬相關(guān)基因的調(diào)控下利用溶酶體降解自身受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的過程。發(fā)生自噬的細(xì)胞內(nèi)可見自噬體空泡結(jié)構(gòu)，包括自噬體、自噬溶酶體、自噬體與溶酶體融合的產(chǎn)物。自噬體的合成、自噬底物的吞噬、自噬溶酶體成熟及溶酶體水解酶對物質(zhì)降解的過程為自噬流[9]。通過這些過程，不必要的細(xì)胞質(zhì)蛋白和細(xì)胞器將被清除，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新[10,11]。各種方式的自噬在生理狀態(tài)下是細(xì)胞的“管家”，可維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，促進(jìn)細(xì)胞存活[12]。然而，在疾病狀態(tài)下，自噬成為一把“雙刃劍”，自噬過度可誘導(dǎo)細(xì)胞向凋亡轉(zhuǎn)化，共同促進(jìn)細(xì)胞死亡[13]。許多研究表明，過度激活的自噬能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡，這是自噬介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的潛在機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，土貝母苷甲作用后，MDA-MB-231細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白LC3相對表達(dá)量顯著增加，進(jìn)一步表明土貝母苷甲誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞死亡是通過自噬介導(dǎo)的。

研究[14]表明，PI3K/Akt/mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常激活后可誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生，這個(gè)過程有細(xì)胞增殖和自噬參與。PI3K/Akt信號(hào)通路的異常激活也被證實(shí)在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[15]。PI3K-Akt-mTOR通路激活可抑制細(xì)胞自噬，該途徑失活則誘導(dǎo)自噬。Akt是PI3K-Akt信號(hào)通路中的主要介質(zhì)。mTOR是PI3K-Akt通路的下游靶點(diǎn)[16]。多項(xiàng)研究表明，自噬過程受mTOR的激活負(fù)性調(diào)控[18]。自噬過程中，PI3K的活性對自噬體形成早期的成核和組裝是必須的。在自噬過程中，溶酶體降解自噬體會(huì)導(dǎo)致P62水平降低。本研究中，土貝母苷甲處理的MDA-MB-231細(xì)胞中P62、PI3K、Akt、p-Akt、P62、p-mTOR的表達(dá)呈劑量依賴性下降，提示土貝母苷甲誘導(dǎo)自噬可能是通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)的。

自噬抑制劑3-MA可通過抑制PI3K的作用來阻斷自噬[17]。3-MA同時(shí)通過增加溶酶體堿性，破壞溶酶體功能，進(jìn)而抑制自噬發(fā)生。本課題組用3-MA預(yù)處理MDA-MB-231細(xì)胞以進(jìn)一步明確土貝母苷甲是否誘導(dǎo)自噬，結(jié)果顯示PI3K抑制劑3-MA顯著緩解了細(xì)胞中p-Akt蛋白水平下降趨勢，推測土貝母苷甲誘導(dǎo)自噬的機(jī)制與下調(diào)Akt活性有關(guān)。抑制PI3K-Akt-mTOR途徑是土貝母苷甲誘導(dǎo)過度自噬的原因，也是自噬調(diào)節(jié)的經(jīng)典途徑。

綜上所述，土貝母苷甲可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡并誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，土貝母苷甲的自噬誘導(dǎo)作用可能是通過調(diào)節(jié)PI3k-Akt-mTOR信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。上述研究結(jié)論為三萜皂苷類化合物治療惡性腫瘤的臨床試驗(yàn)提供了理論基礎(chǔ)。