吳春濤，劉蘇，李擁軍，唐閩，劉鈺，李倩

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，石家莊050000)

高血壓病嚴(yán)重危害人類生命和健康。血壓長期持續(xù)增高使心臟和血管結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而出現(xiàn)靶器官損傷及并發(fā)癥。高血壓病靶器官損傷主要表現(xiàn)之一為左心室肥厚，即心室重構(gòu)，一旦出現(xiàn)容易引起心律失常和心力衰竭[1，2]。有效逆轉(zhuǎn)左心室肥厚和延緩心室重構(gòu)是高血壓病治療的重點。左心室重構(gòu)主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞肥大、心肌凋亡增加、非心肌細(xì)胞(成肌纖維細(xì)胞)及非細(xì)胞成分(膠原纖維)增加、心肌電生理和代謝異常。早期的左心室重構(gòu)以心肌細(xì)胞肥大為主，伴隨心肌細(xì)胞凋亡，結(jié)締組織增生(主要是Ⅰ、Ⅲ型膠原)；后期因Ⅰ/Ⅲ型膠原比例的增加，左心室順應(yīng)性降低，心功能日趨惡化，心室舒張功能減退。我們前期實驗證實微小RNA455(miRNA-455)通過其靶基因鈣網(wǎng)蛋白(Calr)參與升主動脈縮窄后小鼠的心室重構(gòu)[3]。本研究觀察了合并左心室肥厚的高血壓患者血清miRNA-455水平變化，分析其與心肌纖維化指標(biāo)的相關(guān)性，以期為評估高血壓病情提供新的參考指標(biāo)，也為高血壓的診斷治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年2～12月于河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心血管內(nèi)科確診、未經(jīng)治療的原發(fā)性高血壓患者140例為研究對象，其中高血壓2級以上合并左心室肥厚者60例(病例組，男34例、女26例)，單純高血壓2級以上者80例(病例對照組，男42例、女38例)。排除有繼發(fā)性高血壓病、糖尿病和其他心血管疾病患者。另選取在本院進(jìn)行健康體檢的正常人50例作為健康對照組，男27例、女23例。病例組、病例對照組與健康對照組的年齡、性別、有吸煙史者(分別為18、25、13例)、血糖、BMI和肌酐水平等資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義。病例組、病例對照組的收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、左心室質(zhì)量指數(shù)(LVMI)高于健康對照組，且病例組LVMI高于病例對照組(P均<0.01)。見表1。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象均簽署知情同意書。

表1 三組一般資料比較

注：與健康對照組相比，**P<0.01；與病例對照組相比，##P<0.01。

1.2 miRNA-455檢測 抽取各組橈動脈血5 mL于含EDTA抗凝劑的采血管中，靜置1 h，室溫1 200 r/min離心15 min。提取上清液分裝到去RNA酶的EP管中，再以8 000 r/min充分離心5 min，取上層血漿每500 μL分裝至RNase-free EP管中，最終每例收集2～3管，然后放置到-80 ℃低溫冰箱中保存待用。將離心得到的血漿取500 μL到新的離心管中，按照試劑操作說明提取樣本總RNA，放置于-80 ℃低溫冰箱中保存。配制25 μL體系的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。以RNU6B為內(nèi)參，進(jìn)行PCR反應(yīng)，ABI 7500儀檢測miRNA-455的Ct值。以2-ΔCt作為目的miRNA的相對表達(dá)量。

1.3 血清心肌纖維化指標(biāo)檢測 病例組和病例對照組于入院后次日晨(空腹12 h以上)仰臥休息30 min后、健康對照組于體檢當(dāng)日抽取靜脈血3～4 mL，室溫下凝固，4 000 r/min離心10 min，收集上清液，-80 ℃冰箱保存。采用ELISA法檢測各組血清基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子1(TIMP-1)、Ⅰ型膠原氨基端肽(PⅠNP)和Ⅲ型膠原氨基端肽(PⅢNP)，按試劑盒說明進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 各組血清miRNA-455相對表達(dá)量比較 病例組、病例對照組、健康對照組血清miRNA-455相對表達(dá)量分別0.000 071±0.000 044、0.000 230±0.000 066、0.000 385±0.000 242，病例組和病例對照組血清miRNA-455相對表達(dá)量低于健康對照組，且病例組低于病例對照組(P均<0.05)。

2.2 各組血清心肌纖維化指標(biāo)比較 病例組、病例對照組血清PⅠNP、PⅢNP、MMP-9、TIMP-1水平高于健康對照組，且病例組PⅠNP、PⅢNP、MMP-9、TIMP-1水平高于病例對照組(P均<0.05)。病例組、病例對照組MMP-9/TIMP-1低于健康對照組，且病例組MMP-9/TIMP-1低于病例對照組(P均<0.05)。詳見表2。

表2 各組血清PⅠNP、PⅢNP、MMP-9、TIMP-1水平及MMP-9/TIMP-1比較

注：與健康對照組相比，*P<0.05；與病例對照組相比，#P<0.05。

2.3 血清miRNA-455表達(dá)與心肌纖維化指標(biāo)水平的相關(guān)性 將所有研究對象的血清miRNA-455表達(dá)水平與血清纖維化指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，血清miRNA-455表達(dá)水平與血清PⅠNP、PⅢNP、MMP-9、TIMP-1水平均呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.759、-0.823、-0.630、-0.682，P均<0.05)。

3 討論

高血壓后心室重構(gòu)主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞肥大和心肌細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)重構(gòu)。早期的左心室重構(gòu)主要以心肌細(xì)胞肥大為主，伴隨心肌細(xì)胞凋亡，這其實是心臟對壓力負(fù)荷增加的代償反應(yīng)，可以降低升高的室壁張力，維持乃至增加射血分?jǐn)?shù)。但隨著病變進(jìn)行性發(fā)展到后期，凋亡的心肌細(xì)胞逐漸由ECM即心肌膠原代替，導(dǎo)致心功能惡化(如射血分?jǐn)?shù)進(jìn)行性降低等)。膠原(Ⅰ、Ⅲ型膠原為主)為ECM的主要成分，占85%左右[4]，主要由占心肌細(xì)胞總數(shù)2/3的心臟成纖維細(xì)胞合成。心肌纖維化早期Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)、后期Ⅰ型膠原及前膠原蛋白mRNA增加等，導(dǎo)致Ⅰ/Ⅲ型膠原比例增加，出現(xiàn)左心室順應(yīng)性下降，影響其舒張功能。在本研究中也可以看出，高血壓患者血清Ⅰ、Ⅲ型膠原增多，尤其是在高血壓合并心室肥厚的患者更為明顯。膠原基因的轉(zhuǎn)錄及各種基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)調(diào)節(jié)膠原的合成和降解。MMPs是一個內(nèi)源性的鋅依賴性酶家族，通過降解ECM，使纖維膠原降解增加，導(dǎo)致ECM重構(gòu)?；|(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMPs)是MMPs的天然抑制劑。在心肌組織中MMPs與TIMPs之間存在嚴(yán)格的平衡，這種平衡一旦遭到破壞，即MMPs/TIMPs比例失調(diào)(下降)會導(dǎo)致心肌纖維化發(fā)生與進(jìn)行性發(fā)展[5]。有研究顯示，雖然高血壓合并心肌肥厚組的血清MMP-9、TIMP-1水平高于非心肌肥厚組，但其血清NMP-9/TIMP-1比值低于非心肌肥厚組，提示膠原代謝異常在合并心肌肥厚組中更為突出。膠原合成增多，降解抑制進(jìn)一步增強，促使體內(nèi)膠原沉積進(jìn)一步加重,從而促進(jìn)心肌纖維化的發(fā)展[6]。本研究中，血清MMP-9、TIMP-1水平隨著心室肥厚的進(jìn)展而明顯增加，MMP-9/TIMP-1比值下降。

miRNA作為重要的表觀遺傳調(diào)節(jié)分子，通過轉(zhuǎn)錄后負(fù)性調(diào)節(jié)目的蛋白表達(dá)從而參與許多心血管疾病的發(fā)病和進(jìn)展，其中包括心肌肥厚和心肌纖維化。有報道m(xù)iRNA-672通過降低其靶基因JUN延緩血管緊張素Ⅱ和胰島素樣生長因子1刺激的心肌細(xì)胞肥大[7]。miRNA-221/222家族包含轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)信號的幾個基因(包括JNK1、TGF-β1、TGF-β2、ETS-1)，進(jìn)而參與壓力過負(fù)荷引起的心肌纖維化[8]。miRNA-195可通過下調(diào)與瓣膜鈣化相關(guān)的SMAD7表達(dá)，從而促進(jìn)ECM的重塑[9]。近年來，miRNA-455在人類疾病發(fā)病中的作用逐漸受到重視，如在經(jīng)常鍛煉的糖尿病小鼠體內(nèi)miRNA-455表達(dá)上調(diào)，降低了加速纖維化的MMP-9的表達(dá)，從而減少了心血管并發(fā)癥[10]。TGF-β1導(dǎo)致miRNA-455在肺成纖維細(xì)胞中表達(dá)降低，進(jìn)而影響慢性阻塞性肺疾病肺組織的修復(fù)[11]。在心肌成纖維細(xì)胞中，miRNA-455表達(dá)水平與血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；miRNA-455表達(dá)上調(diào)會減輕心肌纖維化[12]。

本課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)，TAC心室重構(gòu)的小鼠心肌中miRNA-455表達(dá)下調(diào)，而上調(diào)miRNA-455表達(dá)可使心肌膠原纖維明顯減少，心肌纖維化指標(biāo)TGF-β1、結(jié)締組織生長因子(Ctgf)表達(dá)降低，抑制心肌纖維化進(jìn)展。隨著基因檢測技術(shù)的發(fā)展，循環(huán)血檢測也可觀察miRNA表達(dá)變化，為臨床研究提供新的實驗室證據(jù)。研究發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定型心絞痛和不穩(wěn)定型心絞痛患者血漿miRNA-149、miRNA-424表達(dá)水平較健康對照者降低，而miRNA-765水平升高[13]；急性心肌梗死時，血清miRNA-1表達(dá)量高于正常對照組[14]。鑒于上述研究結(jié)果，本課題組試圖觀察高血壓合并心心室肥厚患者血清miRNA-455的表達(dá)變化，分析其與心肌纖維化的相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示，病例組和病例對照組血清miRNA-455相對表達(dá)量低于健康對照組，且病例組低于病例對照組，表明高血壓患者血miRNA-455表達(dá)呈下降趨勢，在合并左心室肥厚者miRNA-455表達(dá)下降更明顯，這與前期小鼠實驗結(jié)果相一致。將所有研究對象的血清miRNA-455表達(dá)水平與血清纖維化指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析顯示，血清miRNA-455表達(dá)水平與血清PⅠNP、PⅢNP、MMP-9、TIMP-1水平均呈負(fù)相關(guān)，提示心肌纖維化越嚴(yán)重，血中miRNA-455表達(dá)下降越顯著。結(jié)合上述結(jié)果，我們推測miRNA-455水平可能有助于反映高血壓合并心室肥厚的嚴(yán)重程度及心肌纖維化程度;miRNA-455有可能成為心室肥厚和心肌纖維化新的生物標(biāo)志物，檢測血miRNA-455水平有助于評估高血壓治療效果。