張玉超，李艾帆，李永芳，袁樹華，鄭紅，賀穎

(1鄭州市第一人民醫(yī)院，鄭州450000；2鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

隨著人口老齡化加速，卒中的危害也日益突出。急性缺血性腦卒中(AIS)占腦卒中的45.5%～75.9%，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1，2]。由于AIS病因復(fù)雜，不同病因患者的治療及預(yù)后也不同，因此探討AIS病因及發(fā)病機(jī)制有著重要意義。動脈粥樣硬化是AIS的病理基礎(chǔ)，而動脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定性是引發(fā)AIS的重要病因[3]。近年來很多研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)參與了AIS病理過程中的炎癥反應(yīng)和繼發(fā)性腦損傷[4，5]。MMPs是在細(xì)胞外基質(zhì)降解及再塑中發(fā)揮重要作用的鋅離子依賴的中性蛋白酶家族。其中MMP-2能夠降解纖維帽內(nèi)的膠原纖維，導(dǎo)致動脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定，繼發(fā)腦缺血再灌注損傷等[6，7]。推測MMP-2基因啟動子區(qū)1306位點(diǎn)存在C/T(C1306T)突變，影響MMP-2的表達(dá)，導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)及AIS的發(fā)生。目前國內(nèi)外對MMP-2與AIS關(guān)系的研究結(jié)論尚不一致[8,9]。2016年4月～2018年6月，本研究擬在河南漢族人群中進(jìn)一步探討MMP-2基因C1306T多態(tài)性與AIS的關(guān)系，從而為AIS的精準(zhǔn)預(yù)防提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 隨機(jī)選取2016年4月～2018年6月在鄭州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院且確診的AIS患者300例納入AIS組，TOAST分型[10]大動脈粥樣硬化型(LAA)240例、小動脈閉塞型(SAO)55例、不明原因型(SUE)5例；選擇同期體檢的健康志愿者300例為對照組，性別、年齡均與AIS組相匹配。缺血性腦卒中的診斷根據(jù)第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會議修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)。所有研究對象之間均沒有血緣關(guān)系，且為河南地區(qū)漢族人。本研究通過鄭州市第一人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，研究對象均簽署知情同意書。AIS組合并糖尿病和高血壓比例高于對照組(P均<0.05)。AIS組、對照組的總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白、血糖水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

1.2 MMP-2基因C1306T多態(tài)性觀察 抽取兩組清晨空腹靜脈血3 mL，置于EDTA-Na2抗凝管，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?yán)格按照TIANGEN血液基因組DNA提取試劑盒說明書提取DNA。PCR引物序列設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)[11]，由上海生工有限公司合成。MMP-2基因啟動子區(qū)1306位點(diǎn)上游引物為5′-TCTGGGCCATTGTCAATGTTC-3′，下游引物為5′-TGAGAGATAAGCTGTGATGGG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為196 bp。PCR反應(yīng)體系為15 μL，其中模板DNA 100 ng，10×buffer 1.5 μL，dNTPs 0.3 μL，TaqDNA聚合酶1.0 U、上下游引物各0.25 μL。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min，然后94 ℃ 25 s，54 ℃ 25 s，72 ℃ 40 s，35個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸3 min。下一步進(jìn)行SNaPshot多重單堿基延伸反應(yīng)。MMP-2基因啟動子區(qū)1306位點(diǎn)延伸引物序列為5′-AGACCTGAAGAGCTAAAGAGGT-3′。反應(yīng)體系為6 μL，包括SNaPshot Multiplex Kit 1 μL，純化后的多重PCR產(chǎn)物2 μL，延伸引物0.2 μL及ddH2O 2.8 μL。反應(yīng)條件為96 ℃預(yù)變性1 min，96 ℃變性10 s，52 ℃退火5 s，60 ℃延伸30 s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。最后取1 μL延伸產(chǎn)物，加9 μL上樣HIDI酶，95 ℃變性3 min，立即冰水浴，上測序儀測序并分型。

2 結(jié)果

2.1 兩組MMP-2基因C1306T多態(tài)性分型 MMP-2基因啟動子區(qū)1306位點(diǎn)C/T基因型分布在AIS組和對照組中處于Hardy-Weinberg平衡(P分別為0.937、0.053)，具有群體代表性。兩組MMP-2基因1306位點(diǎn)C/T基因型分布見表1。AIS組MMP-2基因1306位點(diǎn)TT基因型和T等位基因頻率低于對照組(P均<0.05)。在顯性模式和隱性模式中，AIS組CT+TT基因型和TT基因型頻率低于對照組(P均<0.05)。AIS組各亞型MMP-2基因C1306T的T等位基因頻率均低于對照組(P均<0.05)。見表2。為檢驗(yàn)SNaPshot微測序技術(shù)分型結(jié)果的準(zhǔn)確性，從已分型的三種基因型中分別隨機(jī)抽取部分樣本進(jìn)行測序。結(jié)果顯示，SNaPshot微測序技術(shù)的基因分型結(jié)果與測序結(jié)果完全一致。

表1 兩組MMP-2基因C1306T多態(tài)性分布(%)

注：與對照相組比，*P<0.05。

表2 AIS組不同亞型與對照組MMP-2基因C1306T多態(tài)性分布(%)

2.2 MMP-2基因C1306T多態(tài)性與AIS的關(guān)系 以MMP-2基因C1306T多態(tài)性、高血壓、糖尿病、高脂血癥、高同型半胱氨酸為自變量，以AIS是否發(fā)生作為因變量，采用Logistic回歸模型進(jìn)行多因素分析。結(jié)果顯示高脂血癥、高血壓、糖尿病、MMP-2基因C1306T多態(tài)性均可增加AIS的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(P均<0.05)，而高同型半胱氨酸并不增加AIS的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(P>0.05)。詳見表3。

表3 缺血性腦卒中危險(xiǎn)因素的多元逐步Logistic回歸分析結(jié)果

3 討論

AIS是多個(gè)遺傳因素和環(huán)境因素共同作用而導(dǎo)致的一種多基因疾病，基因變異也是AIS的重要發(fā)病因素之一。研究表明腦血管疾病的發(fā)生與年齡、性別、遺傳因素有關(guān)，且與高血壓、吸煙、糖尿病、高脂血癥等有直接相關(guān)性。MMPs是一組同源的、依賴鋅的中性蛋白酶家族，主要由中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等合成與分泌，其主要功能是降解、重塑細(xì)胞外基質(zhì)，維持細(xì)胞外基質(zhì)的動態(tài)平衡。近年來，MMPs在卒中后炎癥反應(yīng)過程中的作用受到學(xué)者普遍關(guān)注，其中對MMP-2和MMP-9的研究最多，它們特異性攻擊Ⅳ型膠原、層黏連蛋白、纖維結(jié)合蛋白，這些均為血管周圍基底膜的主要成分。MMPs與動脈粥樣硬化過程中的炎癥反應(yīng)有關(guān)，能促進(jìn)炎癥細(xì)胞浸潤、平滑肌細(xì)胞增生和遷移、新生血管形成等[12]。MMP-2在腦缺血后再灌注損傷、出血性轉(zhuǎn)化、腦水腫形成、神經(jīng)元凋亡等過程中也發(fā)揮重要作用[13]。MMP-2基因定位于人類染色體16q21，相對分子量為72 kD，其啟動子區(qū)存在C1306T多態(tài)性。有體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MMP-2基因啟動子區(qū)1306位點(diǎn)C等位基因轉(zhuǎn)錄活性顯著高于T等位基因[13]。

多項(xiàng)研究報(bào)道了MMP-2基因C1306T多態(tài)性與AIS的關(guān)系。有學(xué)者[14,15]發(fā)現(xiàn)，MMP-2基因C1306T基因型分布在AIS病例組和對照組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。李鳳等[16]在初發(fā)腦梗死組、復(fù)發(fā)腦梗死組和正常健康組中進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)MMP-2 C1306T基因型和等位基因的頻率分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而劉旭等[17]研究表明，MMP-2基因C1306T多態(tài)性與動脈粥樣硬化性腦梗死的發(fā)病相關(guān)，其中CT基因型可能是動脈粥樣硬化性腦梗死發(fā)病的保護(hù)因素。有學(xué)者[18]研究認(rèn)為，MMP-2基因C1306T多態(tài)性增加了患小血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)。馬巖萍等[19]發(fā)現(xiàn)MMP-2基因多態(tài)性可增加原發(fā)性高血壓患者并發(fā)頸動脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)。邵暄茗等[20]研究發(fā)現(xiàn)MMP-2基因C1306T多態(tài)性與動脈粥樣硬化性AIS發(fā)病關(guān)系密切。

本研究在河南漢族人群中進(jìn)一步探討MMP-2基因C1306T多態(tài)性與AIS的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)AIS組MMP-2基因1306位點(diǎn)TT基因型和T等位基因頻率低于對照組；在顯性模式和隱性模式中，AIS組CT+TT基因型和TT基因型頻率低于對照組。AIS組中的SAO亞型MMP-2基因C1306T的T等位基因頻率低于對照組。Logistic回歸分析結(jié)果顯示，高脂血癥、高血壓、糖尿病、MMP-2基因C1306T多態(tài)性均可增加AIS的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。上述結(jié)果提示，攜帶TT基因型可降低患AIS的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)；相反，攜帶CC基因型和C等位基因可能增加患AIS的風(fēng)險(xiǎn)。我們推測，可能由于MMP-2 C1306T的C等位基因?qū)е翸MP-2基因轉(zhuǎn)錄水平增高，MMP-2基因表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而參與了動脈粥樣硬化的細(xì)胞外基質(zhì)降解、炎癥細(xì)胞浸潤、斑塊破裂等病理過程，形成附壁血栓，血栓脫落后阻塞腦血管，從而引發(fā)AIS及卒中后繼發(fā)性腦損傷。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)MMP-2基因C1306T多態(tài)性可能與AIS的發(fā)病密切相關(guān)，攜帶TT基因型的個(gè)體患AIS的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)降低。由于AIS是由多個(gè)易感基因及環(huán)境因素共同作用的復(fù)雜疾病，而本研究樣本量較小，缺乏大規(guī)模、前瞻性特點(diǎn)，有必要在大樣本、多位點(diǎn)、不同地區(qū)和不同種族的人群中驗(yàn)證上述結(jié)論；另外還需進(jìn)行mRNA和蛋白水平的深入研究，從而闡明MMP-2基因參與AIS發(fā)生的具體遺傳機(jī)制，為AIS的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)和新的思路。