姚軼俊 袁 強(qiáng) 鞠興榮 王立峰

(南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院/江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心1，南京 210023)(江南大學(xué)食品學(xué)院2，無(wú)錫 214122)

近20年來(lái)，隨著經(jīng)濟(jì)的快速增長(zhǎng)和工業(yè)化的發(fā)展，老齡化，空氣污染，和生活方式的改變已經(jīng)使中國(guó)疾病譜發(fā)生了改變。癌癥是全世界人類死亡和疾病的主要原因。大多數(shù)癌癥的痊愈率低，治療費(fèi)用高，因此癌癥給病人帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，并對(duì)他們的生活造成了負(fù)面影響[1]。癌癥是由于環(huán)境因素的累積或基因遺傳，促使正常細(xì)胞不斷生長(zhǎng)分裂導(dǎo)致無(wú)限增殖，最終發(fā)展成為腫瘤；腫瘤細(xì)胞會(huì)逐漸擴(kuò)散到周圍組織，如果不及時(shí)治療，最終會(huì)通過(guò)淋巴系統(tǒng)和血液擴(kuò)散到人體各個(gè)器官和組織[2]。癌細(xì)胞和正常細(xì)胞之間的主要區(qū)別是，前者失去所謂的自毀信號(hào)，生長(zhǎng)和增殖無(wú)限而且雜亂無(wú)章[3]。所以加快對(duì)抗腫瘤機(jī)制研究，找到抑制腫瘤細(xì)胞無(wú)限增殖的手段，從而為臨床醫(yī)學(xué)中抗腫瘤藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)顯得尤為重要[4]。目前的癌癥治療方案中，以肽作為藥物引起了人們的廣泛關(guān)注。多肽擁有一定的關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)來(lái)替代化療分子，例如對(duì)于大多數(shù)小分子藥物，多肽有很好的親和力，目標(biāo)特異性強(qiáng)，毒性低[5]。動(dòng)植物作為潛在抗癌藥來(lái)源已經(jīng)被廣泛的研究，可以通過(guò)降解或加工形成更小分子質(zhì)量、具有天然穩(wěn)態(tài)機(jī)制的蛋白肽[6-7]。王竹君等[8]通過(guò)雙酶水解螺旋藻蛋白，經(jīng)超濾，凝膠色譜分離得到D1組分，通過(guò)分析該組分的氨基酸序列為 AGGASLLLLR，對(duì)HepG-2有顯著的抑制作用。Siri等[9]發(fā)現(xiàn)重組rtEa4肽通過(guò)基質(zhì)膠膜抑制人乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231)的生長(zhǎng)，并且呈現(xiàn)出劑量依賴性，細(xì)胞內(nèi)的uPA，tPA，PAL1等基因的表達(dá)受到了顯著性的抑制。伍強(qiáng)等人以紅毛藻為原料提取R-藻紅蛋白，并通過(guò)胃蛋白酶和胰蛋白酶水解R-藻紅蛋白，分離純化出活性肽ALLAGDPSVLEDR，研究發(fā)現(xiàn)對(duì)癌細(xì)胞(HepG2、SMMC 7721、Caco-2)增殖具有抑制作用[10]。

菜籽蛋白水解物具有較高的生物活性，具有調(diào)節(jié)生理功能的作用，如降血壓，抗氧化，增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)，降膽固醇及抑制腫瘤活性[11-13]，有著很好的發(fā)掘潛力和廣闊的應(yīng)用市場(chǎng)。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)超濾，葡聚糖凝膠柱和半制備液相對(duì)菜籽蛋白水解物進(jìn)行分離純化，并采用MTT法對(duì)各級(jí)組分進(jìn)行分析測(cè)定，研究了各組分對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2、肝癌細(xì)胞HepG2、乳腺癌細(xì)胞MBA-MD-231的生長(zhǎng)抑制作用，并通過(guò)分析各組分對(duì)癌細(xì)胞抑制率影響的差異性確定了抗腫瘤的主要組分，為后續(xù)進(jìn)一步研究菜籽抗腫瘤分子機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

寧雜19號(hào)油菜籽；Sephadex G-15凝膠填料；堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、青鏈霉素混合液、胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%)；乙腈、三氟乙酸Merck公司；噻唑藍(lán)( MTT)、二甲基亞砜( DMSO)；人體肝癌細(xì)胞株HepG2、結(jié)腸癌細(xì)胞株Caco-2、乳腺癌細(xì)胞株MBA-MD-231；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)。

1.2 儀器與設(shè)備

E-812索氏抽提裝置；QL-861漩渦振蕩器；SpectraMax M2e多功能酶標(biāo)儀；HERACELL150i-CO2培養(yǎng)箱；25 cm2密封蓋培養(yǎng)瓶；SX-500快速自動(dòng)高壓滅菌鍋；ALpHA2-4冷凍干燥機(jī)；THZ-D臺(tái)式恒溫振蕩器；膜分離裝置；HD-3紫外檢測(cè)儀；HL-2恒流泵；XWT-S小型臺(tái)式記錄儀；BSZ-100自動(dòng)收集器；PHS-3C雷磁pH計(jì)；RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；HH-6恒溫水浴鍋；XD30A倒置式生物顯微鏡；HERACELL 150i-CO2培養(yǎng)箱。

1.3 方法

1.3.1 菜籽蛋白的制備

將油菜籽脫殼，用索氏抽提脫油，置于通風(fēng)櫥晾干，然后粉碎過(guò)篩。將制得的菜籽粉按1/20的質(zhì)量比充分溶解于去離子水中，然后調(diào)節(jié)溶液的pH至11.0，在室溫下勻速攪拌1 h，然后低速離心(5 000 g，30 min)，收集上清液并調(diào)節(jié)pH為4.5，靜置1h后棄掉上清液，用無(wú)水乙醇洗滌沉淀2～3次，冷凍干燥即得到菜籽蛋白。

1.3.2 菜籽蛋白水解物的制備

取12.5 g菜籽蛋白，用去離子水溶解后配成質(zhì)量濃度為50 mg/mL的溶液，將溶液pH調(diào)至9.0，并加入6 000 U/g的堿性蛋白酶，于55 ℃水浴中酶解3 h后加入4 000 U/g的風(fēng)味蛋白酶繼續(xù)于55 ℃水浴中酶解2 h。水浴過(guò)程中用1 mol/L的NaOH保持pH值恒定，反應(yīng)結(jié)束后煮沸15 min滅酶，冷卻后調(diào)節(jié)pH至7，于50 ℃水浴中酶解2 h，水浴過(guò)程中用1 mol/L的HCl保持pH值恒定，反應(yīng)結(jié)束后煮沸15 min滅酶，冷卻后離心(10 000 g，30 min,4 ℃)，收集上清液，過(guò)0.45 μm微濾膜后冷凍干燥得到菜籽蛋白水解物(RPHs)。

1.3.3 菜籽蛋白水解物的超濾膜分離

將菜籽蛋白水解物(RPHs)溶于去離子水中，配成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液，通過(guò)截留分子質(zhì)量為1 ku的超濾膜，超濾過(guò)程控制壓力在0.10～0.5 MPa之間，分別收集0～3 ku分子質(zhì)量段的菜籽肽液，然后經(jīng)真空濃縮、冷凍干燥，稱量所得該分子質(zhì)量段凍干粉的質(zhì)量。

1.3.4 葡聚糖凝膠柱Sephadex G-15分離純化

在室溫下，將葡聚糖凝膠粉末在去離子水中浸泡至少24 h，并用玻璃棒不斷攪拌以保證凝膠溶脹，直至凝膠充分溶脹，凝膠體積不再變化；根據(jù)填料柱的要求，將溶脹的凝膠同時(shí)放入柱中，應(yīng)注意保持柱子濕潤(rùn)，避免裝柱中出現(xiàn)氣泡或出現(xiàn)分層；上樣前使用至少3-5個(gè)柱體積的去離子水平衡凝膠柱，直到記錄儀的基線穩(wěn)定。

上樣過(guò)程參考了張晶等葡聚糖凝膠G-15柱分離純化的方法[14]。取8g經(jīng)超濾膜分離的菜籽蛋白肽組分(配成質(zhì)量濃度為1 mg/mL)，并過(guò)0.22 μm的濾膜；樣品溶液分多次上樣洗脫，每次上樣約5 mL，洗脫液采用去離子水，恒流泵的流速設(shè)置為18 mL/h，紫外吸收波長(zhǎng)設(shè)置為280 nm，用自動(dòng)收集器每10 min收集一管餾分，合并具有相同最大吸收峰的餾分，將所得餾分進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、冷凍干燥，從而得到葡聚糖凝膠色譜柱分離純化的組分。為了保證分離組分的一致性，凝膠柱在使用10次后作一次清洗，除去凝膠柱中殘留的沉淀和一些頑固的蛋白質(zhì)；方法是用濃度為1 mol/L氫氧化鈉，流速為40 mL/h，反向洗脫凝膠柱3～4個(gè)柱體積，再用去離子水正向沖凝膠柱3～4個(gè)柱體積再生。

1.3.5 半制備型RP-HPLC分離純化

參照文獻(xiàn)[15]，并做一定修改。采用半制備型RP-HPLC對(duì)經(jīng)2.2.3分離得到的功能活性最高的組分進(jìn)一步分離純化。將樣品配制成0.1 mg/mL溶液后采用0.22 μm一次性過(guò)濾器過(guò)濾。色譜柱采用XBridgeTM C18 (10 mm×150 mm, 5 μm)，進(jìn)樣體積為100 μL，液相洗脫條件如表1，其中流動(dòng)相A：100%超純水(含0.1 %三氟乙酸)，流動(dòng)相B：100%乙腈(含0.1 %三氟乙酸)，柱溫箱溫度30 ℃，洗脫流速2.46 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)215 nm，收集主要洗脫峰，真空濃縮并冷凍干燥后檢測(cè)各組分的功能活性。色譜圖采用系統(tǒng)自帶的Empower 2(Water，USA)積分軟件處理。

表1 半制備液相RP-HPLC洗脫條件

1.3.6 細(xì)胞培養(yǎng)

人體肝癌細(xì)胞HepG2、人體結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2和人體乳腺癌細(xì)胞MBA-MD-231，用含有 10%胎牛血清 (FBS)，0.1% 雙抗的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于37 ℃，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，隔天換液，使用顯微鏡觀察細(xì)胞在培養(yǎng)瓶底部的生長(zhǎng)情況，待細(xì)胞在瓶底長(zhǎng)滿后，加入1.5 mL 0.25%的胰酶，放置在培養(yǎng)箱中消化3 min，待細(xì)胞脫落后，用移液槍將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到離心管中離心3 min(1 000 r/min，4 ℃)，然后吸取1 mL培養(yǎng)液加入到離心管中緩慢吹打20次左右，使細(xì)胞密度均勻，按照1∶2或1∶3進(jìn)行傳代。

1.3.7 抗腫瘤活性分析

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞、Caco-2細(xì)胞及MBA-MD-231細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用DMEM完全培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至1×105個(gè)/mL，將細(xì)胞懸浮液接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入100 μL細(xì)胞懸浮液，同時(shí)設(shè)置空白組(只加入100 μL不含細(xì)胞的培養(yǎng)液，不加細(xì)胞和樣品)；將96孔板置于37 ℃、5%CO2條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，24 h后吸棄培養(yǎng)液，并向每孔中加入100 μL用DMEM稀釋的不同質(zhì)量濃度(50，100，200，300，400，500，1 000 μg/mL)的待測(cè)樣品，每個(gè)濃度均設(shè)6個(gè)重復(fù)，對(duì)照組加入等體積的DMEM培養(yǎng)液；將培養(yǎng)板置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，繼續(xù)孵育24 h，24 h后在各孔中加入5 mg/mL的MTT 20 μL，在37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μL DMSO，37 ℃下于恒溫振蕩器上振蕩30 min，待結(jié)晶全部溶解后，置于570 nm下測(cè)定OD值。細(xì)胞存活率和細(xì)胞抑制率參照張子棟等[16]的方法分別按式(1)、式(2)計(jì)算：

(1)

細(xì)胞抑制率=

(2)

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)定3次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。所有的圖形用Graphpad prism 6作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菜籽蛋白水解物的超濾分析

2.1.1 超濾膜分離組分得率

由表2可知，通過(guò)超濾分離技術(shù)將菜籽蛋白水解物分離得到了分子質(zhì)量小于1 ku的組分，該組分(RPHs)占菜籽蛋白水解物的比例為51.8%，這表明大部分的菜籽蛋白被堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶水解成低分子質(zhì)量的可回收的菜籽多肽。同時(shí)，分子質(zhì)量<3 ku的菜籽多肽約占總水解物的71.58%，此結(jié)果與Girgih等[17]的研究相似，他們發(fā)現(xiàn)亞麻籽肽經(jīng)超濾膜分離后，其中小于3 ku的組分得率是其他各組分得率的3 倍。

表2 RPHs超濾膜分離組分得率

2.1.2 超濾膜分離組分的抗腫瘤活性分析

菜籽蛋白水解物經(jīng)超濾膜分離后，選取三種腫瘤細(xì)胞(人體肝癌細(xì)胞株HepG2、結(jié)腸癌細(xì)胞株Caco-2、乳腺癌細(xì)胞株MBA-MD-231)對(duì)其進(jìn)行體外抗增殖活性分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，在質(zhì)量濃度為50～1 000 μg/mL的劑量范圍內(nèi)，RPHs對(duì)HepG2細(xì)胞、MBA-MD-231細(xì)胞及Caco-2細(xì)胞均有一定的抑制作用，且抑制效果與樣品濃度之間呈現(xiàn)出一定的劑量關(guān)系。其中，1 000 μg/mL樣品作HepG2細(xì)胞24 h，抑制率達(dá)到(30.66±3.53)%，高于MBA-MD-231細(xì)胞(21.34±2.67)%及Caco-2細(xì)胞(15.03±1.78)%，研究表明HepG2細(xì)胞對(duì)RPHs的作用最敏感，所以在接下來(lái)的試驗(yàn)中選取HepG2細(xì)胞來(lái)分析菜籽蛋白水解物的抗腫瘤活性。

a

b

圖1 不同濃度的RPHs對(duì)3種腫瘤細(xì)胞活力和抑制率的影響

2.2 菜籽蛋白水解物的凝膠色譜分析

2.2.1 Sephadex G-15凝膠色譜分離

經(jīng)過(guò)超濾膜分離的組分RPHs進(jìn)一步通過(guò)葡聚糖凝膠色譜柱(Sephadex G-15)進(jìn)行洗脫分離，得到了2個(gè)洗脫峰，以洗脫時(shí)間為X軸，以紫外檢測(cè)的 OD值為Y軸作圖，結(jié)果如圖2所示；收集這2個(gè)主要的峰，并分別命名為RPHs-F1和RPHs-F2。根據(jù)葡聚糖凝膠柱分離的工作原理可知，RPHs-F2的分子質(zhì)量小于RPHs-F1。收集各組分的洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，冷凍干燥，儲(chǔ)存于-20 ℃下待用。

圖2 Sephadex G-15分離純化RPHs的柱層析圖

2.2.2 凝膠色譜分離組分的抗腫瘤活性分析

以HepG2細(xì)胞為研究對(duì)象，采用MTT比色法對(duì)葡聚糖凝膠色譜柱分離所得的組分進(jìn)行體外抗增殖活性的分析。由圖3可知，兩種組分RPHs-F1、RPHs-F2不同濃度給藥處理HepG2細(xì)胞24 h，在質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL時(shí)，抑制率分別為(18.34±2.44)%，(35.58±2.90)%，說(shuō)明組分RPHs-F2的抗腫瘤活性優(yōu)于組分RPHs-F1，并且與分離前組分(抑制率30.66%)相比，抗腫瘤活性有了一定程度的提升；因此，經(jīng)葡聚糖凝膠色譜柱純化的RPHs(MW<1 ku)具有更高的抗腫瘤活性。

a

b

圖3 不同濃度的凝膠色譜分離組分對(duì)HepG2細(xì)胞活力和抑制率的影響

2.3 菜籽蛋白水解物的半制備型RP-HPLC分析

2.3.1 半制備型RP-HPLC分離純化

利用半制備液相RP-HPLC對(duì)經(jīng)超濾膜分離及葡聚糖凝膠柱Sephadex G-15柱層析獲得的具有較高活性的功能菜籽肽組分(RPHs-F2)進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化，如圖4所示，得到4個(gè)主要組分，按照出峰順序依次命名為RPHs-F2-1、RPHs-F2-2、RPHs-F2-3及RPHs-F2-4，以HepG2細(xì)胞為模型分別測(cè)定了這4個(gè)組分的體外抗增殖活性。

圖4 半制備RP-HPLC分離純化RPHs-F2 的液相色譜圖

2.3.2 半制備RP-HPLC分離組分的抗腫瘤活性分析

半制備RP-HPLC能根據(jù)多肽分子質(zhì)量大小、結(jié)構(gòu)等分理處單一組分的肽，對(duì)低分子質(zhì)量肽具有較高的分辨率及純化度，是目前分離、純化多肽的主要方法之一。分子質(zhì)量較低的RPHs-F2經(jīng)半制備液相分離后得到4種組分，分別對(duì)4種進(jìn)行體外抗增殖活性分析，結(jié)果如圖5所示，組分RPHs-F2-4對(duì)HepG2細(xì)胞的體外增殖幾乎沒(méi)有抑制作用(在質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL時(shí)，對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制率為11.53%)；其余3個(gè)組分的抑制作用則相對(duì)明顯，且與作用濃度之間呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性；在各組分樣品質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL時(shí)，組分RPHs-F2-1，RPHs-F2-2，RPHs-F2-3對(duì)HepG2細(xì)胞體外增殖的抑制率分別為(28.58±2.93)%，(21.23±4.07)%，(51.53±5.59)%；結(jié)果表明，菜籽肽組分RPHs-F2-3顯示出更強(qiáng)的抗腫瘤活性。通過(guò)與相關(guān)文獻(xiàn)中菜籽蛋白水解物各組分的抗炎活性對(duì)比，發(fā)現(xiàn)菜籽蛋白組分的抗腫瘤活性與菜籽抗炎肽的呈現(xiàn)出一定的相關(guān)性，來(lái)路皓等[18]通過(guò)合成γ-炔酸酯類化合物，并檢測(cè)此種化合物的抗炎和抗腫瘤活性，發(fā)現(xiàn)其是一種雙重抑制劑，表現(xiàn)出抗炎和抗腫瘤的雙重活性；劉仁杰等[19-21]利用縮合和環(huán)化手段合成異長(zhǎng)葉烷基喹唑啉類衍生物3a～3f，通過(guò)MTT法對(duì)合成所得化合物進(jìn)行了人體肝癌細(xì)胞抗腫瘤活性

圖5 不同濃度的半制備液相分離組分對(duì)HepG2細(xì)胞活力和抑制率的影響

測(cè)定，以及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞抗炎活性測(cè)定，研究發(fā)現(xiàn)化合物3f既有較強(qiáng)抗腫瘤的活性也有一定的抗炎活性，因此可以預(yù)測(cè)抑制炎癥發(fā)生信號(hào)通路和與抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的信號(hào)通路可能有相同的關(guān)鍵因子。其中抗腫瘤活性的具體抑制機(jī)制，需要后續(xù)進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究分析。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)將脫殼、脫油后的菜籽餅粕通過(guò)堿提酸沉的方法制備得到菜籽蛋白，進(jìn)一步通過(guò)分步酶解(堿性蛋白酶-風(fēng)味蛋白酶)制備菜籽蛋白水解物；在經(jīng)過(guò)超濾、葡聚糖凝膠柱(Sephadex G-15)以及半制備液相RP-HPLC等一系列分離純化手段，采用MTT比色法分析RPHs(MW<1 ku)對(duì)人體HepG2肝癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞MBA-MD-231及人體結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2的體外抗增殖活性，篩選出敏感細(xì)胞株；進(jìn)一步測(cè)定各組分對(duì)敏感細(xì)胞株HepG2細(xì)胞的體外增殖抑制作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在質(zhì)量濃度為50～1 000 μg/mL的劑量范圍內(nèi)，RPHs對(duì)HepG2細(xì)胞、MBA-MD-231細(xì)胞及Caco-2細(xì)胞均有一定的抑制作用，且抑制效果與樣品濃度之間呈現(xiàn)出一定的劑量關(guān)系。對(duì)同一種細(xì)胞而言，樣品濃度越高，抑制效果越顯著；其中，HepG2細(xì)胞對(duì)RPHs的作用最為敏感；所以在接下來(lái)的試驗(yàn)中選取HepG2細(xì)胞來(lái)分析菜籽蛋白水解物的抗腫瘤活性。對(duì)葡聚糖凝膠色譜柱分離所得的組分進(jìn)行體外抗增殖活性的分析，兩種組分RPHs-F1、RPHs-F2在質(zhì)量質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL時(shí)，對(duì)HepG2細(xì)胞抑制率分別為(35.58±2.90)%，(18.34±2.44)%，說(shuō)明組分RPHs-F2的抗腫瘤活性優(yōu)于組分RPHs-F1，并且與分離前組分(抑制率30.66%)相比，抗腫瘤活性有一定的增強(qiáng)。組分RPHs-F2-4對(duì)HepG2細(xì)胞的體外增殖幾乎沒(méi)有抑制作用；其余3個(gè)組分的抑制作用則相對(duì)明顯，且與作用濃度之間呈現(xiàn)一定劑量依賴性；在樣品質(zhì)量質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL時(shí)，組分RPHs-F2-3對(duì)HepG2細(xì)胞體外增殖的抑制率最高，為(51.53±5.59)%，所以菜籽肽組分RPHs-F2-3具有更強(qiáng)的抗腫瘤活性。