黃慧娟 喬玉潔 張軍東

上海建華精細(xì)生物制品有限公司 上海 201611

玻璃酸鈉注射液適用于變形性膝關(guān)節(jié)病，肩關(guān)節(jié)周圍炎。玻璃酸鈉注射液注入關(guān)節(jié)腔內(nèi)，可覆蓋和保護(hù)關(guān)節(jié)組織，改善潤(rùn)滑功能；改善關(guān)節(jié)炎患者日?；顒?dòng)及關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍[1]。玻璃酸鈉注射液作為注射劑應(yīng)嚴(yán)格控制樣品中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量，避免臨床使用中熱原反應(yīng)的發(fā)生，。國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)-玻璃酸鈉注射液（標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：WS1-（X-058）-2006Z-2011）中細(xì)菌內(nèi)毒素應(yīng)小于0.1EU/mg；而日本藥典（JP XVII）[2]中玻璃酸鈉注射液細(xì)菌內(nèi)毒素的限度為應(yīng)小于0.03EU/mL。為了提高產(chǎn)品的質(zhì)量保障水平，增強(qiáng)國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)能力，本文將按照2015年版《中國(guó)藥典》四部通則1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法[3]建立動(dòng)態(tài)顯色法檢測(cè)玻璃酸鈉注射液細(xì)菌內(nèi)毒素含量的方法。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 儀器

LKL164-03（64孔）動(dòng)態(tài)試管檢測(cè)儀（湛江安度斯生物有限公司）；Eppendorf微量取液器（50～1000μl）；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，無(wú)熱原試管及無(wú)熱原槍頭（湛江安度斯生物有限公司）；QL-901型漩渦混勻器（海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司）；BS124S分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）

1.2 藥品與試劑

動(dòng)態(tài)顯色法鱟試劑（湛江安度斯生物有限公司，批號(hào)1804200，靈敏度0.005～50EU/mL）；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（廈門(mén)市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司，批號(hào)18016003，5.0ml/支）；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)150601-201885，80EU/支）；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（廈門(mén)市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司，批號(hào)160301，15EU/支）；玻璃酸鈉注射液（上海建華精細(xì)生物制品有限公司自制，批號(hào)1803291、1804201、1805101，規(guī)格 2.5ml：25mg）

2 方法

2.1 細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）的確定

依據(jù)日本藥典（JP XVII）中玻璃酸鈉注射液細(xì)菌內(nèi)毒素限值標(biāo)準(zhǔn)（應(yīng)小于0.03EU/mL），確定本品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查限值為應(yīng)小于0.03EU/mL。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)

將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解稀釋，用漩渦混勻器溶解完全后進(jìn)一步進(jìn)行梯度稀釋得到細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為50，5，0.5，0.05，0.005EU/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，各取0.1ml分別加至含有0.1ml鱟試劑的反應(yīng)管中，混合后插入動(dòng)態(tài)試管檢測(cè)儀中，每個(gè)濃度平行3管進(jìn)行檢測(cè)，并以2管細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水作空白對(duì)照。檢測(cè)溫度為37℃±1℃，設(shè)置波長(zhǎng)為405nm，達(dá)限值為92%，反應(yīng)時(shí)間為3600s，儀器自動(dòng)以細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)（lgC）為橫坐標(biāo)，反應(yīng)時(shí)間的對(duì)數(shù)（lgT）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程并計(jì)算相關(guān)系數(shù)。

2.3 最小有效稀釋濃度（C）的確定

供試品C計(jì)算公式為C=λ/L，式中L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值0.03EU/mL，λ為標(biāo)準(zhǔn)曲線上最低的內(nèi)毒素濃度0.005EU/mL，得出供試品的C為0.167ml/ml。

2.4 干擾試驗(yàn)

根據(jù)2015年版《中國(guó)藥典》四部通則1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法規(guī)定，，本試驗(yàn)選擇0.5EU/mL為λm，添加至供試品中進(jìn)行供試品干擾試驗(yàn)。取三批玻璃酸鈉注射液各1g，精密稱定，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水分別稀釋至0.167ml/ml，即為供試品溶液；同時(shí)用供試品溶液制備含有細(xì)菌內(nèi)毒素濃度為0.5EU/mL的溶液為供試品陽(yáng)性溶液。取細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品1支加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水1ml，置渦旋混合器上混合5分鐘，即得標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液梯度稀釋至5EU/mL，0.5EU/mL，0.05EU/mL，0.005EU/mL，即為細(xì)菌內(nèi)毒素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水為陰性對(duì)照。依照“1.3.2”項(xiàng)下方法測(cè)定，其中細(xì)菌內(nèi)毒素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液平行3管，其他溶液平行2管。儀器自動(dòng)按所得線性回歸方程分別計(jì)算出供試品溶液和供試品陽(yáng)性溶液的內(nèi)毒素含量并得出該試驗(yàn)條件下的回收率，應(yīng)在50%～200%之間。

2.5 樣品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

取3批樣品進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算供試品細(xì)菌內(nèi)毒素含量，以EU/mL表示，并進(jìn)行樣品細(xì)菌內(nèi)毒素回收率的測(cè)定。

3 結(jié)果

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性

根據(jù)2015年版《中國(guó)藥典》四部通則1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法規(guī)定，當(dāng)陰性對(duì)照的反應(yīng)時(shí)間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)反應(yīng)時(shí)間，將全部數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸，根據(jù)線性回歸分析，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)的絕對(duì)值大于或等于0.980，各組平行試管的變異系數(shù)均小于10%，試驗(yàn)方為有效。經(jīng)檢測(cè)，標(biāo)準(zhǔn)曲線得到回歸方程lgT=2.7224-0.2701lgC，相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值為0.9999，標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性試驗(yàn)有效，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 動(dòng)態(tài)顯色法標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性試驗(yàn)結(jié)果

3.2 干擾試驗(yàn)結(jié)果

玻璃酸鈉注射液在稀釋至0.167ml/ml的濃度下內(nèi)毒素的回收率均在50%～200%的范圍內(nèi)，表明在該稀釋倍數(shù)下不存在增強(qiáng)或抑制的干擾作用，且測(cè)得的內(nèi)毒素?cái)?shù)據(jù)真實(shí)有效。供試品干擾試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 供試品干擾試驗(yàn)結(jié)果

3.3 樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)結(jié)果

采用上述動(dòng)態(tài)顯色法對(duì)三批玻璃酸鈉注射液樣品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素含量測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程lgT=2.5490-0.2744lgC，相關(guān)系數(shù)為0.9985，計(jì)算樣品濃度0.167ml/ml下的細(xì)菌內(nèi)毒素含量，供試品原液內(nèi)毒素含量均＜0.005EU/mL，樣品濃度為0.167ml/ml，得到樣品細(xì)菌內(nèi)毒素含量均＜0.03EU/mL，且試驗(yàn)結(jié)果均符合有效性要求，檢驗(yàn)結(jié)果符合限度要求。

4 討論

本研究通過(guò)2015年版《中國(guó)藥典》四部通則1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法以及參考文獻(xiàn)資料[4-8]，建立了動(dòng)態(tài)顯色法檢測(cè)玻璃酸鈉注射液細(xì)菌內(nèi)毒素含量的方法，研究結(jié)果表明玻璃酸鈉注射液在6倍稀釋濃度下的樣品溶液不存在干擾作用，檢測(cè)三批次自制樣品，結(jié)果顯示樣品細(xì)菌內(nèi)毒素含量均＜0.03EU/mL，符合日本藥典（JP XVII）中玻璃酸鈉注射液細(xì)菌內(nèi)毒素限值標(biāo)準(zhǔn)。動(dòng)態(tài)顯色法是檢測(cè)反應(yīng)混合物的吸光度或透光率達(dá)到某一預(yù)先設(shè)定的檢測(cè)值所需要的反應(yīng)時(shí)間，該方法相比常用的凝膠法能夠準(zhǔn)確的測(cè)出細(xì)菌內(nèi)毒素的含量，且操作簡(jiǎn)便，數(shù)據(jù)具有可追溯性。本研究試驗(yàn)方法穩(wěn)定，能準(zhǔn)確檢測(cè)樣品中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量，可用于玻璃酸鈉注射液產(chǎn)品細(xì)菌內(nèi)毒素含量的測(cè)定。