劉宏揚 黃 麗 張昆麗 翁長江* 楊玉瑩

（1.長江大學 動物科學學院，湖北荊州 434025；2.中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所 基礎(chǔ)免疫創(chuàng)新團隊/獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150069）

Pten，又稱為MMACI基因或者TEP1[1]，是一個重要的抑癌基因，該基因具有脂質(zhì)磷酸酶活性和蛋白磷酸酶活性。Pten基因定位于染色體10q23，基因編碼403個氨基酸，由N端180個氨基酸的催化區(qū)、中部165個氨基酸的C2區(qū)和C端50個氨基酸的尾區(qū)組成[2-5]。Pten基因在體內(nèi)幾乎所有組織器官中廣泛表達，參與了機體內(nèi)的多種生理功能。Pten與多種蛋白結(jié)合對PIP3、MAPK及FAK等通路有調(diào)控作用。Pten通過調(diào)控PIP3的去磷酸化影響細胞增殖與凋亡[6]；通過調(diào)控黏著斑激酶（FAK）的磷酸化作用抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲[7]。有研究表明，Pten通過抑制促細胞分裂素激活的蛋白激酶（MAPK）信號轉(zhuǎn)導抑制細胞的生長和分化[8，9]。

Pten基因異常表達與人類多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)[10]。Pten失活導致細胞增殖和凋亡失衡，使腫瘤細胞失控性的生長、增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移[11]。Yu等研究發(fā)現(xiàn)肝癌組織中Pten的表達顯著低于非腫瘤組織[12]。最近研究表明，肝癌組織中Pten基因的缺失或失活與肝癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等功能密切相關(guān)[4，13]。

本課題利用Cre/Loxp條件基因敲除技術(shù)構(gòu)建肝臟內(nèi)特異性敲除Pten基因的小鼠模型，為在體內(nèi)研究Pten基因在肝臟相關(guān)疾病中所起的作用提供研究模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

C57BL/6J品系的Ptenflox/flox小鼠來自于軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所楊曉教授，肝臟特異表達Cre重組酶的工具鼠購買自南京大學模式動物研究所。所有的動物飼養(yǎng)繁殖在中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心（SPF級）進行。所有小鼠均飼養(yǎng)于12h/12 h 光照/黑暗條件下，自由采食和飲水，所有操作均符合實驗動物倫理學要求。

圖1 肝臟特異性Pten基因敲除小鼠模型的打靶策略（1A）與流程圖（1B）

1.1.2 主要試劑

NaCl、EDTA、Tris base、SDS、瓊脂糖粉等化學試劑購自sigma公司；Proteinase K購自Thermo Fisher公司；2 × Ex Taq PCR Mix酶、DNA maker DL2000 購自寶生物工程（大連）有限公司；SYBR Premix EX Taq II、PrimeScriptTMRT reagent kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Takara公司；GAPDH單克隆抗體，Pten多克隆抗體購自武漢三鷹公司；Anti-Mouse IgG（H+L）DyLight? 800-Labeled（042-07-18-06）購自美國KPL公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

低溫高速離心機購于Beckman公司；小型臺式離心機購于Eppendorf公司；細胞培養(yǎng)箱購于Thermo公司；恒溫水浴鍋購于Thermo公司；熒光定量PCR儀Aligent Mx3005P購自美國Aligent公司；紅外掃膜儀購自美國Licor公司。

1.2 方法

1.2.1 肝臟特異性Pten基因敲除小鼠模型構(gòu)建策略

Ptenflox/flox小鼠打靶策略如圖1A所示，在Pten基因的4號和5號外顯子兩端插入Loxp位點?；贑re/Loxp系統(tǒng)原理，Ptenflox/flox小鼠與肝臟特異性表達Cre重組酶小鼠（Alb-Cre）交配，Cre重組酶特異性識別Loxp位點，通過同源重組實現(xiàn)靶基因在肝臟內(nèi)特異性敲除。具體流程為：首先將Ptenflox/flox小鼠與Alb-Cre小鼠進行交配，篩選出F1代，基因型為Ptenflox/+/Alb-Cre小鼠。F1與Ptenflox/flox小鼠交配，篩選出F2代基因型為Ptenflox/flox/Alb-Cre小鼠。F2代小鼠與Ptenflox/flox小鼠交配，獲得F3代基因型為Ptenflox/flox/Alb-Cre小鼠（肝臟特異性基因敲除小鼠）和Ptenflox/flox小鼠（實驗對照組小鼠）（圖1B）。

1.2.2 肝臟特異性Pten基因敲除小鼠的基因型鑒定

對5周齡左右的小鼠進行耳標標記，對應耳標號剪下約2 mm左右的鼠尾，置于1.5 ml EP管內(nèi)，加入500 μl組織裂解液（1 M Tris-HCL pH 8.0，0.5 M EDTA pH 8.0，3 M NaCl，10% SDS）和1μl蛋白酶K（10 mg/mL）。56 ℃水浴消化過夜。第二天將樣品室溫放置10 min，12000 rpm/min離心15 min，取上清400 μl加入等量異丙醇上下反復顛倒混勻，待析出白色絮狀沉淀后，12000 rpm/min離心，棄上清，75%酒精洗一遍后，加雙蒸水溶解。依據(jù)打靶策略設(shè)計的基因型鑒定引物（表1）進行PCR擴增。PCR擴增反應體系（20 μl）：Ex Taq Mix 10μl，引物各1 μl，模板1 μl，ddH2O 7 μl。Cre基因PCR擴增條件：98℃ 2 min，98℃ 30 s，58℃30 s，72℃ 30 s，（35 Cycle），72℃ 5 min。Flox基因擴增條件：98 ℃ 2 min，98℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，（35 Cycle），72℃ 5 min。取PCR反應終產(chǎn)物10 μL進行1.2% 瓊脂糖凝膠核酸電泳鑒定肝臟特異性Pten基因敲除小鼠基因型。

1.2.3 RNA提取及Real-Time PCR檢測

圖2 Pten基因敲除小鼠基因型鑒定

圖3 小鼠肝臟、肺臟以及腎臟組織中Pten基因 mRNA水平檢測

圖4 小鼠肝臟、肺臟以及腎臟組織中Pten蛋白表達水平鑒定

選取6周齡小鼠，依據(jù)Trizol法提取RNA的步驟進行小鼠肝臟、肺臟以及腎臟總RNA的提取，將濃度稀釋成50 ng/μl的RNA進行反轉(zhuǎn)錄反應，制備成20μl體系的DNA樣本，作為 熒光定量PCR反應模板，用于檢測肝臟組織中Pten基因的mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，鑒定敲除效率。Real-Time PCR 使用的Pten基因上游引物為：5'-CAGCCAAGTCTGTGACTTGCCGTAC-3'，下游引物為：5'-CCGCTCGAGCAGTCGCTGCAACCATCCA-3'。內(nèi)參GAPDH上游引物為：5- AAATGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3，下游引物為：5- CAACAATCTCCACTTTGCCACTG -3。反應體系（20 μl）：2× SYBR Premix EX Taq Ⅱ 10 μl，PCR Forward Primer（10 μm）1 μl，PCR Reverse Primer（10 μM）1 μl，DNA 模板2 μl，滅菌蒸餾水6 μl。反應條件：Step1，95 ℃ 30 s；Step2，95℃ 5 s；60℃ 30 s，72 ℃ 30 s，（35 Cycle）；Step3：Melt Curve。

1.2.4 小鼠組織總蛋白提取及Western Blot檢測

選取經(jīng)過PCR驗證后的6周齡Ptenflox/flox/Alb-Cre小鼠與Ptenflox/flox小鼠，取其不同組織。使用強RIPA組織裂解液提取小鼠肝臟、肺、腎臟組織總蛋白。取大約100mg組織于研缽中，邊加液氮邊研磨至粉末狀，轉(zhuǎn)移至1.5ml EP管中加入1 ml RIPA裂解液，冰上裂解30min，12000 rpm/min 4℃ 離心20min，吸取裂解上清，使用BCA法測定蛋白濃度。加入5 × SDS-PAGE Loading Buffer，100℃煮沸10 min，樣品經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離后，濕轉(zhuǎn)至NC膜上；5 %脫脂乳室溫封閉，分別以抗Pten或抗GAPDH mAb（1：1 000）為一抗，以羊抗鼠Goat anti-rabbit IgG（H+L）（1∶2 0000）作為二抗，通過紅外掃膜儀進行掃描。

2 結(jié)果

2.1 Ptenflox/ flox/Alb-Cre小鼠基因型鑒定

提取Ptenflox/flox/Alb-Cre小鼠與Ptenflox/flox小鼠交配產(chǎn)生的7只子代小鼠的基因組DNA，分別使用 Flox基因和Cre基因特異性引物對小鼠的基因型進行PCR鑒定。結(jié)果如圖2所示，從第2、3、5、6、7只小鼠的基因組DNA中擴增出512bp 的 Cre 基因 片段（圖2A），7只小鼠的基因組DNA中均擴增出300 bp 的 flox基因 片段（圖2B）。由此判定，第2、3、5、6、7只小鼠為Ptenflox/flox/Alb-Cre小鼠，而第1和第4只小鼠為Ptenflox/flox小鼠。

表1 基因型鑒定的引物信息2

2.2 mRNA水平檢測

分別提取Ptenflox/flox/Alb-Cre和Ptenflox/flox基因敲除小鼠的肝臟、肺臟、腎臟總RNA，用Real-time PCR方法檢測這三個組織中Pten的mRNA水平。結(jié)果如圖3所示，與Ptenflox/flox小鼠相比，Ptenflox/flox/Alb-Cre小鼠肝組織中Pten mRNA水平顯著降低（P<0.0001）；而肺臟和腎臟組織中Pten的mRNA水平?jīng)]有明顯變化。

2.3 蛋白水平鑒定

分別提取Ptenflox/flox/Alb-Cre和Ptenflox/flox的肝臟、肺臟、腎臟組織總蛋白，用Western Blot方法檢測Pten的蛋白水平。結(jié)果如圖4所示，與Ptenflox/flox小鼠相比，Ptenflox/flox/Alb-Cre小鼠肝臟中Pten蛋白的表達量顯著降低，而 Ptenflox/flox/Alb-Cre小鼠與Ptenflox/flox小鼠的肺及腎臟中Pten蛋白表達量無差異，由此說明 Pten基因僅在肝臟組織中被敲除。

3 討論

最近幾年來，基因敲除技術(shù)迅速發(fā)展，基因敲除模型被廣泛應用于生物學領(lǐng)域[14]。但是基因敲除小鼠的某些基因缺失可能造成生長發(fā)育或生殖功能障礙，不易獲得純合型后代[15]。因此構(gòu)建條件基因敲除小鼠模型，使某段基因在動物體內(nèi)的特定組織器官內(nèi)失活，是研究該基因在特定組織器官內(nèi)功能最為有效的方法。條件性基因敲除是通過把兩個LoxP位點插入到目的基因的一個或幾個重要外顯子的兩端以制備出有兩個LoxP位點Knockout-floxed小鼠[16]，Knockout-floxed小鼠與組織特異性表達Cre酶的小鼠進行雜交后，可以在特定的組織或細胞中敲除該基因，而該基因在其它組織或細胞表達正常[17]。

利用Cre-Loxp基因敲除系統(tǒng)，在Pten基因的4號和5號外顯子外側(cè)插入了Loxp位點，得到Ptenflox/flox小鼠并與特異性表達Cre酶的工具鼠交配，經(jīng)過多代次的繁育，成功獲得Pten基因敲除小鼠Ptenflox/flox/Alb-Cre。

通過對肝臟特異性Pten基因條件敲除小鼠的生長繁殖情況的觀察，我們發(fā)現(xiàn)Pten基因條件敲除小鼠的生長情況與對照組相比并無顯著差異，小鼠繁殖能力良好，子代生長發(fā)育情況正常。采用Genotyping的方法對5周左右的小鼠進行基因型鑒定，成功篩選出Ptenflox/flox/Alb-Cre和Ptenflox/flox小鼠。與Ptenflox/flox小鼠相比。Ptenflox/flox/Alb-Cre 小鼠肝臟組織中Pten的mRNA水平及蛋白質(zhì)水平均有顯著降低，表明我們成功得到Pten 肝臟特異性條件基因敲除小鼠，為探究Pten基因在肝臟疾病中的的作用提供了重要動物模型。