劉 晴 古佳玉 趙紫偉 趙林姝 郭會君 謝永盾 宋希云 劉錄祥,?

(1青島農(nóng)業(yè)大學生命科學學院,山東青島 266109;2中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所/國家農(nóng)作物基因資源與基因改良重大科學工程/國家農(nóng)作物航天誘變技術改良中心,北京 100081)

研究表明,降低株高是矮稈基因功能的具體體現(xiàn),引起植株矮化的機制較復雜,涉及因素廣泛,其中植物激素在植物生長發(fā)育的不同階段發(fā)揮著重要作用[1]。六大類植物內源激素中,生長素類(auxin,IAA)、赤霉素類(gibberellins,GAs)、細胞分裂素類(cytokinins,CTK)、油菜素甾醇類(brassinosteroids,BRs)屬于生長促進劑,乙烯(ethylene)和脫落酸(abscisic acid,ABA)屬生長抑制劑[2-3]。不同激素的調節(jié)功能存在差異,如IAA 是最早發(fā)現(xiàn)的植物激素,其具有促進營養(yǎng)生長過程中的胚芽鞘和莖生長,抑制根生長,維持頂端優(yōu)勢等生理作用[4]。GAs 為四環(huán)二萜類化合物,分為C19GAs 和C20GAs 兩大類,目前已有超過136 種不同形式赤霉素的結構和性質被確定,如GA1、GA3等[5],其在種子萌發(fā)、節(jié)間伸長、開花、結實等生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的調控作用[6-10],且GAs 對莖稈伸長的調節(jié)作用效果顯著[11-12],因此植物體內活性GAs 含量的動態(tài)平衡至關重要。ABA 作為生長抑制劑可通過阻止細胞壁酸化和細胞伸長,進而抑制胚芽鞘、胚軸、嫩枝等器官的伸長生長[13]。

此外,植物體中各激素間存在交互作用,如GA3能促進內源IAA 含量提高,同時使用GA3和IAA 較單一激素更能顯著促進植物節(jié)間伸長[14-15]。研究表明,當GAs 或BR 的信號傳導受阻或生物合成受到抑制時,植株表現(xiàn)為矮化[1];蔡鵬[16]研究發(fā)現(xiàn)IAA 或某些基因的不正常表達也會導致少數(shù)植株矮化。前人通過研究與激素代謝密切相關的矮化突變體,明確了基因突變是致矮的主要因素。此外,研究發(fā)現(xiàn)GAs、IAA、BR 等激素合成相關基因的突變會導致植物體內源激素動態(tài)平衡紊亂以及激素信號傳導發(fā)生突變,中斷正常信號通路會導致植株矮化[1]。

小麥(Triticum aestivum L.)作為世界三大主要糧食作物之一,其產(chǎn)量和消費量約占世界谷物的30%,貿易量約占世界谷物的45%,株高是決定小麥產(chǎn)量的重要因素,矮稈抗倒伏是小麥育種的主要目標性狀之一[17]。目前小麥矮稈基因較單一化且遺傳背景狹隘,僅有農(nóng)林10 號的Rht-B1b、Rht-D1b 和赤小麥的Rht8在育種中被廣泛利用,小麥產(chǎn)量和育成品種的遺傳多樣性不能滿足考種需求[18]。因此,發(fā)掘新的矮稈基因和矮源材料是當前小麥矮化育種的主要目標。

育種過程中常用的矮稈基因大多是通過自發(fā)突變和物理或化學誘發(fā)突變產(chǎn)生。誘發(fā)突變技術通過提高誘變率,誘發(fā)產(chǎn)生自然界稀有或一般方法較難獲得的新類型、新性狀或新基因,加速育種進程,為選育突破性新品種創(chuàng)造條件[19]。據(jù)不完全統(tǒng)計,全世界已通過物理、化學等誘變技術,在糧食作物、經(jīng)濟作物、蔬菜、花卉等164 種植物上育成2 500 多個突變品種和數(shù)萬份突變資源[20]。突變體DC20 是D6-3(wide type,WT)經(jīng)北京正負電子對撞機實驗室通過高能混合粒子束模擬次級宇宙射線,構成高能混合粒子輻射場處理后選育獲得的株高穩(wěn)定降低、植株株型緊湊、抗倒伏、豐產(chǎn)性能好,而產(chǎn)量與WT 無差異的矮稈植株。

轉錄組是特定生理或發(fā)育階段條件下,細胞整套轉錄本的集合,通過轉錄組學分析,不僅能挖掘到基因組功能要素,而且可以揭示組織或細胞內分子成分與生物學進程,進而闡釋植物的發(fā)育與病理機理[21]。目前RNA-Seq 數(shù)據(jù)分析在研究植物特異突變、特定發(fā)育時期、生物與非生物脅迫等方面應用廣泛,如曹樺等[22]通過轉錄組學分析研究了鐵皮石斛葉色突變體的形成機理,但目前關于小麥矮稈突變體轉錄組學研究報道尚不常見。本研究通過對矮稈突變體DC20 及其WT 進行轉錄組測序與比較分析,篩選差異表達基因,以期為小麥突變體DC20 矮化的分子機理研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

矮稈突變體DC20 是高稈親本D6-3(WT)經(jīng)185 Gy 的高能混合粒子場處理篩選所得。突變體DC20和WT 于2013年10月均種植于中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所中圃場實驗基地,行長2 m,行距30 cm,株距6 cm,常規(guī)田間管理,DC20(62.13 cm)成熟期的株高較WT(76.35 cm)極顯著下降了18.6%。

圖1 野生型(WT)與突變體DC20 株高表型性狀Fig.1 Phenotypic trait of plant height from wild type(WT)and the mutant DC20

取孕穗期的WT 和突變體DC20 莖稈材料,各樣品均設3 次生物學重復,取樣后立即置于液氮中并在研缽中充分研磨至粉末狀,準確稱取50.0 mg 干粉置于2.0 mL 的硬質塑料管中(AXYGEN,USA),-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 文庫的構建和測序 按照plus 植物總RNA 提取試劑盒[天根生化(北京)科技有限公司]操作說明書提取RNA。分別用Nanodrop 2000 微量紫外分光光度計(美國賽默飛世爾有限公司)、1%瓊脂糖凝膠電泳和Agilent 2100 芯片生物分析儀(美國安捷科技有限公司)檢測RNA 的濃度和完整性。1.9 ≤OD260/OD280≤2.1;OD260/OD230≥1.8;RIN≥6.5 被認為是質量合格的樣品,可用于文庫的構建。按照Illumina Gene Expression Sample Prep Kit(百邁客生物科技有限公司)說明書構建cDNA 文庫并進行質控檢測,然后用Illumina HiSeqTM2000 進行轉錄組雙端測序。

1.2.2 轉錄組數(shù)據(jù)分析 使用In-house perl 腳本處理測序產(chǎn)出的原始數(shù)據(jù),去除含有接頭、poly-N 及低質量reads 后獲得高質量clean reads(有效讀長),并對Q20、Q30、GC 含量以及重復序列水平進行統(tǒng)計;將上述高質量clean reads 與小麥中國春參考基因組(IWGSC1_popseq.31 版本)進行比對,應用Tophat2 工具進行精準匹配,達到100%匹配或僅有1 個堿基錯配的reads,才可用于后續(xù)功能注釋分析。使用BLAST軟件(Version 2.2.26)將獲得的通用基因(Unigene)序列與NCBI non-redundant protein sequences (NR)、Protein family ( Pfam )、UniProt/Swiss-Prot、Gene Ontology(GO,http：/ /www.geneontology.org)、Clusters of Orthologous Groups of proteins(KOG/COG,http：/ /www.ncbi.nlm.nih gov/COG/)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG,http：/ /www.genome.jp/kegg/)數(shù)據(jù)庫進行比對,并根據(jù)基因在不同樣品或樣品組中的表達量進行差異表達基因功能注釋的分析。

1.2.3 激素含量的測定 將冷凍莖稈干粉樣品送至北京林業(yè)大學化學實驗室,采用LC-MS/MS 法檢測孕穗期WT 和DC20 莖稈內激素GA1、GA3、IAA 和ABA的含量,利用Logit 曲線換算激素濃度(ng·mL-1)后,再計算各樣品激素含量(ng·g-1FW)。

式中,Logit 表示各濃度顯色值,B 代表各濃度的顯色值,B0代表0 ng·mL-1孔的顯色值。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

通過FPKM 數(shù)值對基因表達水平進行定量分析,對有生物學重復的樣品, 利用DEGseq R 軟件(1.10.1)進行差異表達分析統(tǒng)計,本研究中閾值為Pvalue≤0.01 和|log2fold changes|≥1 的基因即為顯著差異表達基因。

2 結果與分析

2.1 轉錄組數(shù)據(jù)分析

2.1.1 基因組裝分析 利用Illumina HiSeq 高通量測序平臺對已構建好的6 個cDNA 文庫進行測序,產(chǎn)出22 300 297～37 909 000 不同數(shù)目的clean reads;每組材料的GC 含量均基本呈隨機分布且無偏差;通常質量控制參數(shù)Q30＞80%表示測序質量非常可靠,本試驗中Q30＞86.56%表明測序數(shù)據(jù)質量高,建庫理想。將匹配上的reads 使用Trinity 進行組裝,將其在各大數(shù)據(jù)庫中進行基因功能注釋,發(fā)現(xiàn)所有的Unigenes 在COG、GO、KEGG、Swiss-Prot、NR 中注釋條目較多,且長度分布在1 000 bp 以上,表明測序產(chǎn)出質量較高,所得基因功能注釋條目數(shù)較多,可用于后續(xù)矮稈突變體中差異表達基因的挖掘及對矮化分子機制的相關代謝途徑的探討。

2.1.2 差異表達基因統(tǒng)計分析 將WT 與突變體DC20 轉錄組數(shù)據(jù)進行差異分析,通過FPKM 值和以|log2fold changes|≥1,閾值P-value≤0.01 為篩選條件查找差異表達基因并進行聚類分析。由圖2 可知,WT與DC20 間的差異基因有2 153 個(上調基因425 個,下調基因1 728 個)。

圖2 分組差異表達基因聚類分析Fig.2 The cluster of differentially expressed genes in different groups

2.1.3 差異表達基因功能注釋和富集分析 對差異表達基因在各個數(shù)據(jù)庫進行功能注釋,GO 富集表明差異基因主要集中在細胞進程(cellular process)(80.63%)、新陳代謝(metabolic term)(72.73%)、單一生物進程(single-organism process)(73.77%)、刺激反應(response to stimulus) (57.39%)、生物調節(jié)(biological regulation)(48.61%)及其他信號傳遞、生長等生物學過程中;差異基因主要分布在細胞內成分(intracellular components) (90.40%)、細胞(cell)(87.69%)、細胞器內成分(cell component)(79.91%)以及膜成分(membrane component)(41.59%);分子功能主要包括結合(binding)(61.24%)和催化反應活性(catalytic activity)(51.11%)等功能(圖3-A)。

由COG 注釋可知差異基因多集中在通用功能預測( general function prediction only, R ) ( 761,16.77%), DNA 復制、重組和修復( replication,recombination and repair,L)(458, 10.09%),轉錄調控機制(transcription,K)(412,9.08%),信號轉導機制(signal transduction mechanisms,T)(333,7.34%),轉錄后修飾、蛋白轉運與分子伴侶(posttranslational modification, protein turnover, chaperones,O) (296,6.52%),翻譯、核糖體結構與生物合成(translation,ribosomal structure and biogenesis,J)(293,6.46%)和細胞周期調控、細胞分裂、染色體分離(cell cycle control,cell division, chromosome partitioning,D)(201,4.43%)等功能條目上(圖3-B)。

KEGG 注釋表明,差異基因主要富集在苯丙酸生物合成( phenylpropionic acid biosynthesis) (145,11.09%)、淀粉和蔗糖的代謝(starch and sucrose metabolism) ( 88, 6.73%)、苯 丙 氨 酸 代 謝(phenylalanine metabolism)(88,6.73%)、植物激素信號轉導(signal transduction of plant hormones) (81,6.20%)等通路(圖3-C)。

圖3 WT 和DC20 間差異表達基因注釋分類統(tǒng)計圖Fig.3 The classifications of DEGs between WT and DC20

進一步對差異基因進行生物學進程分析,發(fā)現(xiàn)植物激素的信號轉導(signal transduction of plant hormones)和細胞分裂(cell division)、細胞生長調節(jié)(cell growth regulation pathways)通路的所有基因均為下調(圖4)。

2.1.4 差異表達基因注釋數(shù)據(jù)挖掘分析 結合NCBI數(shù)據(jù)庫中已有的通路信息,發(fā)現(xiàn)矮稈突變體DC20 中與植物激素信號轉導相關的差異基因幾乎都下調表達(表1)。

調取赤霉素合成通路所有已知合成酶基因與基因序列,與數(shù)據(jù)進行比對,找到了CPS、KS、KO、KAO、GA20ox 相關基因。其中赤霉素生物合成途徑的早期合成酶基因CPS、KS、KO 的表達量均下調,與內源赤霉素含量下降的結果一致(表2)。GA20ox 是赤霉素合成通路中的主要反饋調控節(jié)點,在突變體DC20的轉錄組中GA20ox 的上調可能與反饋調控相關。

圖4 WT 和DC20 在不同細胞進程中差異表達基因數(shù)Fig.4 The number of DEGs in different cellular processes between WT and DC20

2.2 激素含量分析

由表2 可知,WT 中各內源激素含量均明顯高于DC20,其中WT 中GA1和IAA 含量顯著高于突變體DC20,WT 中的GA3含量極顯著高于DC20,WT 中的ABA 含量與DC20 差異不顯著,表明DC20 株高的降低可能與GAs 和IAA 含量降低有關。

表2 赤霉素合成途徑的差異表達基因Table 2 DEGs in gibberellin synthesis pathway

表3 小麥莖稈內不同激素含量Table 3 Results of different hormone content in wheat stalk

3 討論

內源激素作為植物體內的“第一信使”,可介導植物體不同生長和發(fā)育過程,貫穿整個生命周期,對植物生長發(fā)育和生理活動調節(jié)具有重要作用[23]。在調節(jié)植物發(fā)育過程中,激素可通過調控細胞分裂和細胞長度達到控制株高的目的[24-25]。GH3 家族(GH3.1、GH3.2、GH3.5、GH3.6、GH3.17)編碼生長素酰胺合成酶,促使植物體內冗余的IAA 與氨基酸結合形成IAA-氨基酸復合物,從而維持植物體內IAA 的動態(tài)平衡,促進植株生長發(fā)育[26-28]。而SAUR 基因的誘導表達抑制了植株生長,導致突變體呈現(xiàn)矮化表型[29]。IAA5是一類生長素快速響應因子,具有生長調節(jié)作用[30]。本研究中突變體DC20 中的GH3、IAA 和AUX1 等生長促進因子表達下調,而抑制因子SAUR 表達上調,表明生長素的動態(tài)平衡調節(jié)以及信號轉導途徑,是影響細胞周期調控和細胞伸長的關鍵因素,與前人研究一致。

大量研究表明,GAs 生物合成酶基因的缺失可導致植株出現(xiàn)葉色加深、莖稈短粗、開花延遲等變異,施加外源GA3可部分恢復株高、花期等表型[31-32]。Yamaguchi 等[33]對擬南芥和水稻進行研究,結果表明植物體內源GAs 的生物合成途徑的早期合成酶包括古巴焦磷酸合酶(copalyl pyrophosphate synthase,CPS)、內根-貝殼杉烯合成酶(kaurene synthase,KS)、內根-貝殼杉烯氧化酶(kaurene oxidase,KO)和內根-貝殼杉烯酸氧化酶(kaurene acid oxidase,KAO)4 類。前體牻牛兒基二磷酸(geranylgeranyl pyrophosphat,GGDP)被上述4 類酶催化合成GAs 前體GA12,此生物途徑已在小麥中被鑒定[34-35]。本研究中突變體DC20的CPS、KS、KO 和KAO 的編碼基因均下調表達,與激素鑒定中GA1和GA3含量降低的結果一致。擬南芥突變體ga1、ga2 和ga3 由于分別缺失了CPS、KS 和KO 活性,內源GAs 合成停留在早期合成途徑,活性GAs 嚴重缺失,導致植株出現(xiàn)雄性不育和嚴重矮化的突變表型[36-38]。突變體DC20 中CPS、KS、KO 和KAO的編碼基因雖然都下調表達,但內源GA1和GA3的缺失并不嚴重,因此僅表現(xiàn)出半矮生的突變表型,育性幾乎不受影響。內源GAs 生物合成途徑的晚期合成酶包括催化活性GAs 生成的GA20ox 和GA3ox,以及催化活性GAs 失活的GA2ox。晚期合成酶兼具反饋調控的功能,植物有機體通過抑制或激活其活性來調節(jié)內源GAs 的動態(tài)平衡[39]。本研究中突變體DC20 內源GA1和GA3含量降低,GA20ox 的上調表達正好符合反饋調控機制。由此可見,突變體DC20 的矮化表型與內源GAs 的合成調控密切相關,但是具體調控機制還有待進一步研究。

4 結論

本研究通過運用轉錄組學分析表明,參與細胞周期調控和細胞伸長的差異表達基因在矮稈突變體DC20 中下調表達;參與生長素動態(tài)平衡調節(jié)、信號轉導和赤霉素生物合成的基因在DC20 中下調表達,相關抑制因子則上調表達。輻射誘變產(chǎn)生的突變,主要通過調控植物激素合成及信號轉導途徑來影響細胞周期調控和細胞伸長,最終產(chǎn)生DC20 的矮化表型。下一步可對DC20 突變性狀基因進行定位,并克隆該基因。本研究結果為闡明矮稈突變體形成的分子調控機理研究奠定了一定的理論基礎。