楊軍　劉金森　郝禎燕　王霞　王力強(qiáng)

非洲豬瘟病毒傳染性強(qiáng)，死亡率幾乎達(dá)到100%，目前還沒(méi)有可用于預(yù)防和治療的疫苗。1921年于非洲東部肯亞確認(rèn)。1957年傳出非洲，進(jìn)入西班牙。在2007年開始進(jìn)入俄羅斯境內(nèi)，2017年3月，俄羅斯伊爾庫(kù)茨克爆發(fā)非洲豬瘟疫情，該病由此從中東歐地區(qū)傳播至俄羅斯東部，距離中國(guó)邊界僅1000公里，威脅亞洲。2018年8月，我國(guó)發(fā)生了首例非洲豬瘟（African Swine Fever，ASF）的感染，這是我國(guó)首次發(fā)生非洲豬瘟疫情，截至2019年4月19日，全中國(guó)大陸31個(gè)省市自治區(qū)都傳出豬瘟疫情。非洲豬瘟是一種高度接觸性傳染病，該病屬于世界動(dòng)物衛(wèi)生組織的法定報(bào)告動(dòng)物疫病。目前，尚無(wú)有效的非洲豬瘟疫苗和治療方法。因此，在屠宰養(yǎng)殖企業(yè)快速準(zhǔn)確鑒定非洲豬瘟成為迫切需求。本文將對(duì)屠宰養(yǎng)殖企業(yè)利用LAMP方法快速非洲豬瘟與實(shí)驗(yàn)室操作注意事進(jìn)行闡述。

非洲豬瘟對(duì)我國(guó)的豬屠宰養(yǎng)殖企業(yè)的打擊是非常沉重的，現(xiàn)在迫切的需要一套切實(shí)可行的防止辦法，定期的在豬屠宰養(yǎng)殖企業(yè)的豬抽樣檢查是很有必要的，及時(shí)發(fā)現(xiàn)傳染源，切斷傳播途徑，可以避免財(cái)產(chǎn)損失，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)LAMP方法由于其簡(jiǎn)單快速準(zhǔn)確特點(diǎn)，適用于我國(guó)的豬屠宰養(yǎng)殖企業(yè)鑒定篩查非洲豬瘟病毒。

非洲豬瘟（African Swine Fever，ASF）由非洲豬瘟病毒引起的豬急性烈性傳染病，由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染，其屬非洲豬瘟病毒科，具有彩虹病毒的外觀，痘病毒的內(nèi)涵。該病毒是一種二十面體對(duì)稱，帶囊膜的雙鏈DNA病毒，直徑172～220nm，似六角形，基因組全長(zhǎng)170kd，核苷酸序列已全部測(cè)定，含有151個(gè)開放性閱讀框，5個(gè)多基因家族編碼200多種蛋白，其中113種病毒蛋白的結(jié)構(gòu)和功能已經(jīng)清楚，32種為結(jié)合蛋白。病毒粒子含有至少28種結(jié)構(gòu)蛋白，在感染細(xì)胞內(nèi)有100種以上的病毒誘導(dǎo)蛋白，至少有50種能與感染豬或康復(fù)豬的血清反應(yīng)。根據(jù)單抗分析結(jié)果表明，抗原變異主要發(fā)生于結(jié)構(gòu)蛋白P150、P14、P12。標(biāo)準(zhǔn)的免疫學(xué)試驗(yàn)不能區(qū)分病毒株，但根據(jù)限制性內(nèi)切酶分析能將病毒株區(qū)別，并分為不同基因型。

自然感染和人工感染此病毒均不產(chǎn)生型的中和抗體，究其原因，可能與免疫組織的損傷、病毒基因組的遺傳變異、抗原競(jìng)爭(zhēng)、免疫抑制、免疫逃避等有關(guān)。非洲豬瘟病毒對(duì)溫度和酸的抵抗能力很強(qiáng)，室溫干燥或冰凍數(shù)年仍存活，室溫中經(jīng)18個(gè)月仍能從血液和血清中分離出病毒。對(duì)高熱敏感，在60℃經(jīng)30min即死亡。對(duì)許多脂溶劑和常用消毒劑敏感。

日本學(xué)者Notomi等開發(fā)了一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法，即環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)（Loop-mediatedisothermal amplification，LAMP），其特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物，利用鏈置換DNA聚合酶（Bst DNA poLymerase）在等溫條件（65℃左右）保溫幾十分鐘，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。不需要模板的熱變性、長(zhǎng)時(shí)間溫度循環(huán)、繁瑣的電泳、紫外觀察等過(guò)程，基因的擴(kuò)增和產(chǎn)物的檢測(cè)可一步完成。

2019年1月4日中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心發(fā)布了《關(guān)于公布第一批非洲豬瘟現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)試劑評(píng)價(jià)結(jié)果的通知》，由國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)院研發(fā)、北京森康生物技術(shù)開發(fā)有限公司生產(chǎn)的“非洲豬瘟病毒LAMP檢測(cè)試劑盒”成功入圍，這也是本次非洲豬瘟現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)試劑評(píng)價(jià)中唯一入圍的“核酸等溫?cái)U(kuò)增類”檢測(cè)試劑。

LAMP試劑盒診斷敏感性100%、診斷特異性100%、不需要特殊儀器、快速、結(jié)果判定簡(jiǎn)單，是屠宰養(yǎng)殖企業(yè)鑒定非洲豬瘟病毒的優(yōu)選策略。

一、材料與方法

1、血液樣本采集

實(shí)驗(yàn)人員事先消毒后，使用無(wú)菌的采血器對(duì)抽樣選取的豬進(jìn)行口腔靜脈取血（圖1）。血液低溫4℃保存不超過(guò)24h，若需長(zhǎng)期存放，需放置-80℃冰箱，盡量避免反復(fù)凍融（不超過(guò)3次）。

2、血液樣本處理

取血液樣本2ul，將10ul的PBS（PH7.2，含有1萬(wàn)單位青霉素和1萬(wàn)單位鏈霉素）均勻之混合，靜置70℃，30min后滅活，3000r/min，4℃離心5min，取上清液，編號(hào)備用。

3、LAMP擴(kuò)增步驟

①反應(yīng)預(yù)混液配置（配置和分裝在冰上進(jìn)行）

每個(gè)樣本配置16ul LAMP buffer，5.5ul引物液，0.5ulCMR染料，1.0ulBST酶，總反應(yīng)液應(yīng)比全部樣本個(gè)數(shù)另外多加3例樣本的體積。

②反應(yīng)預(yù)混液分裝

將配置的反應(yīng)預(yù)混液渦旋均勻，瞬時(shí)離心后，按每管23ul分裝與LAMP管內(nèi)。

③加樣

向?qū)?yīng)LAMP管加入上述處理的血液樣品20ul。同時(shí)，向陽(yáng)性對(duì)照管內(nèi)加入20ul陽(yáng)性對(duì)照，向陰性對(duì)照管內(nèi)20ul DEPC水。

④加入礦物油

向每管加入礦物油20ul，蓋緊管蓋，瞬時(shí)離心，轉(zhuǎn)移至檢測(cè)區(qū)。

⑤檢測(cè)

將離心后的LAMP管放入檢測(cè)儀內(nèi)，設(shè)定好檢測(cè)樣品（S）、陽(yáng)性對(duì)照（PC）、陰性對(duì)照的（NC）的位置，反應(yīng)參數(shù)設(shè)置：采用64℃ 60min，每1min采集一次FAM通道熒光信號(hào)，共60個(gè)循環(huán)。

二、結(jié)果與分析

LAMP反應(yīng)結(jié)果，由圖2可見，左側(cè)編號(hào)為4號(hào)為陽(yáng)性對(duì)照，2號(hào)為陰性對(duì)照。有結(jié)果可以看出所有樣品均沒(méi)有感染非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）。

三、討論

非洲豬瘟疫情迅猛，屠宰養(yǎng)殖企業(yè)為了有效避免財(cái)產(chǎn)損失，及時(shí)發(fā)現(xiàn)傳染源，終止疫情傳播，是迫切手段，也是必要手段。太高的靈敏度使得其比普通PCR擴(kuò)增更加容易污染導(dǎo)致假陽(yáng)性。因此，必須高度重視擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。常規(guī)措施包括嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)分區(qū)、添加UNG和dUTP（可能導(dǎo)致反應(yīng)效率下降）、使用熒光定量等不開蓋檢測(cè)方法。實(shí)驗(yàn)室一旦遭到污染，所有相關(guān)試劑必須全部更換，必要時(shí)還得更換實(shí)驗(yàn)室。本文針對(duì)屠宰養(yǎng)殖企業(yè)小型實(shí)驗(yàn)室操作注意事項(xiàng)做出如下總結(jié)：

1、實(shí)驗(yàn)室試劑嚴(yán)格按要求低溫存放，避免污染;

2、采血器保證無(wú)菌，實(shí)驗(yàn)環(huán)境無(wú)菌，實(shí)驗(yàn)室定期紫外殺菌照射;

3、抽樣的樣本數(shù)量選取分群隨機(jī)抽樣辦法，符合統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，具有代表性;

4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄，存檔;

5、實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，切記不要打開反應(yīng)管，避免造成環(huán)境污染，按照實(shí)驗(yàn)試劑按照廢液處理。

由于屠宰企業(yè)中豬數(shù)量龐大，在抽樣時(shí)因注意選取數(shù)據(jù)量小的樣本反映大的總體研究特性，誤差范圍在可以接受范圍內(nèi)?；趶堉菊\(chéng)提出的基于地理學(xué)第一定律在疫病風(fēng)險(xiǎn)管理和控制中風(fēng)險(xiǎn)鄰近概念，即在空間和時(shí)間上鄰近的事件對(duì)與其相鄰的空間單元和時(shí)間單元的風(fēng)險(xiǎn)影響要遠(yuǎn)大于較遠(yuǎn)的空間和時(shí)間單元的影響權(quán)重，建議采用分群隨機(jī)抽樣辦法，例如對(duì)從外地引進(jìn)的豬和本地豬分開成兩個(gè)獨(dú)立的群體，獨(dú)立抽樣，例外，成年與否、性別甚至是不同的品種也可以加權(quán)考慮在內(nèi)，盡量做到滿足代表性的原則。

此外，屠宰企業(yè)中對(duì)場(chǎng)地和設(shè)施的消毒也是避免感染的重要的一環(huán)，對(duì)豬舍定時(shí)清潔，及時(shí)定期的消毒，對(duì)糞便等污物作化學(xué)處理后采用深埋、堆積發(fā)酵或焚燒等方式處理。對(duì)辦公、飼養(yǎng)人員的宿舍、公共食堂等場(chǎng)所，可采用噴灑方式消毒。對(duì)消毒產(chǎn)生的污水應(yīng)進(jìn)行無(wú)害化處理。飼養(yǎng)管理人員可采取淋浴消毒。對(duì)衣、帽、鞋等可能被污染的物品，可采取消毒液浸泡、高壓滅菌等方式消毒。

最后，LAMP鑒定非洲豬瘟方法已經(jīng)在一些屠宰養(yǎng)殖企業(yè)加以利用，可以快速準(zhǔn)確的鑒定非洲豬瘟，盡可能的保障人民和企業(yè)的財(cái)產(chǎn)安全。希望屠宰養(yǎng)殖企業(yè)能規(guī)范養(yǎng)殖和屠宰操作，防患非洲豬瘟與未然。

總之，非洲豬瘟對(duì)我國(guó)的豬屠宰養(yǎng)殖企業(yè)的打擊是非常沉重的，定期的在豬屠宰養(yǎng)殖企業(yè)的豬抽樣檢查是很有必要的，及時(shí)發(fā)現(xiàn)傳染源，切斷傳播途徑，可以避免財(cái)產(chǎn)損失，經(jīng)試驗(yàn)證明，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)LAMP方法由于其簡(jiǎn)單快速準(zhǔn)確特點(diǎn)，適用于我國(guó)的豬屠宰養(yǎng)殖企業(yè)鑒定篩查非洲豬瘟病毒。

（作者單位：015000內(nèi)蒙古巴彥淖爾市臨河區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督管理所）