段 磊，王 霞，王夢(mèng)圓，宋亞男

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林吉林 132101）

大花三色堇（Viola × wittrockiana.Gams.）又名貓臉花、蝴蝶花，其品種豐富、花色艷麗、抗凍性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，深受人們喜歡，并被譽(yù)為“花壇皇后”。大花三色堇在歐洲、美國和日本非常盛行，這些國家自19世紀(jì)便開始了大花三色堇的品種選育工作，現(xiàn)已取得了顯著的成效，培育出了多種新奇的優(yōu)良品種[1]。而我國針對(duì)大花三色堇品種選育方面的研究尚處于起步階段，栽種的多為進(jìn)口F1代種子，這些種子不僅成本高，而且對(duì)我國生境的適應(yīng)能力差，因此，隨著市場(chǎng)需求量的增加，選育適應(yīng)中國生境、植株健壯、抗性強(qiáng)、具有中國知識(shí)產(chǎn)權(quán)的優(yōu)良品種已是當(dāng)務(wù)之急。

種質(zhì)資源遺傳多樣性研究是進(jìn)行新品種選育的重要內(nèi)容。目前，我國針對(duì)大花三色堇遺傳多樣性方面的研究較少，僅有2例DNA分子標(biāo)記方面研究的報(bào)道[1，2]，尚無利用簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增（inter-simple sequence repeat，簡(jiǎn)稱ISSR）技術(shù)研究大花三色堇種質(zhì)資源分類方面的報(bào)道。本試驗(yàn)利用ISSR技術(shù)分析24份大花三色堇材料的遺傳多樣性分析，為大花三色堇優(yōu)良種質(zhì)資源的收集、分類和良種繁育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

24份供試材料分別購自甘肅酒泉金秋園藝種業(yè)有限公司、美國泛美種子公司、英國弗倫諾瓦公司和北京花仙子農(nóng)業(yè)有限公司（見表1）。

將種子消毒后接種于不添加任何激素的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行無菌培養(yǎng)，至三葉期取其葉片，于-20℃冷凍保存，備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取

參照王健[2]的方法，采用改良的SDS法提取大花三色堇葉片基因組DNA，然后分別利用核酸分析儀和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA的純度和濃度，稀釋DNA濃度至50 ng/μl，-20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 試劑

taq DNA聚合酶、dNTPs、SDS等藥品均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

注：a：甘肅酒泉金秋園藝種業(yè)有限公司；b：美國泛美種子公司；c：英國弗倫諾瓦公司；d：北京花兒朵朵花仙子農(nóng)業(yè)有限公司。

1.2.3 ISSR-PCR擴(kuò)增

在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選用10條擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定、多態(tài)性強(qiáng)的引物擴(kuò)增24份材料的基因組DNA，20μl的ISSRPCR反應(yīng)體系，包括Mg2+2.5 mmol·L-1、Taq DNA聚合酶1.2U、dNTPs 0.2 mmol·L-1、引物0.4 umol·L-1、DNA模板50ng。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)熱5 min；94 ℃變性40s，51℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，39個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min；4℃保溫。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理及分析

統(tǒng)計(jì)擴(kuò)增條帶，有帶記為1，無帶記為0，建立0、1矩陣圖，利用NTSY-pc2.1軟件計(jì)算不同樣品間的遺傳相似系數(shù)，并作聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA質(zhì)量檢測(cè)

24份材料基因組DNA的電泳條帶清晰、明亮、無拖尾現(xiàn)象，核酸分析儀檢測(cè)顯示OD260/OD280值均在1.8-1.9范圍內(nèi)，DNA質(zhì)量濃度在155-295 ug/mL范圍內(nèi)，所提基因組DNA純度較高，可用作ISSR分析。

2.2 ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果多態(tài)性分析

10條引物擴(kuò)增24份材料樣品基因組DNA，擴(kuò)增總片段數(shù)為91，其中多態(tài)性條帶數(shù)為79，多態(tài)性比率為86.81%。

2.3 聚類分析

將24份材料基因組DNA 的擴(kuò)增條帶轉(zhuǎn)化為0、1二元矩陣圖，計(jì)算遺傳相似系數(shù)，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建 UPGMA 聚類圖，結(jié)果如圖1所示，可知在遺傳相似系數(shù)0.44處，24份材料可以分為2大類群，分別是美國泛美的XXL-YB和英國弗倫諾瓦的PAN575R聚為I類，其余為第II類，遺傳相似系數(shù)為0.47時(shí)，第II類又可以分為2個(gè)亞類，其中酒泉金秋園藝公司的229.04與美國泛美種子公司的M-YC為A亞類，酒泉金秋園藝公司的其余品種與花仙子農(nóng)業(yè)公司的2個(gè)品種為B亞類，且B亞類中顏色相近者、同一系列品種多聚在一起，可見，材料地理來源、顏色以及品系是影響大花三色堇遺傳多樣性的重要因素。

圖1 24份大花三色堇的ISSR聚類圖

3 討論

ISSR技術(shù)是顯性標(biāo)記，它結(jié)合了RAPD的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)克服了RAPD、SSR、RFLP等技術(shù)的缺點(diǎn)，不需要預(yù)先知道靶標(biāo)DNA序列，具有高效、快速、穩(wěn)定、易操作、成本低等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛用于指紋圖譜構(gòu)建、親緣關(guān)系鑒定、遺傳多樣性分析等領(lǐng)域[3]。本研究通過分析24份大花三色堇材料的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)國內(nèi)材料遺傳距離較近，結(jié)果同RAPD標(biāo)記[2]和基于主成分的聚類分析[4]結(jié)果一致，說明現(xiàn)有國內(nèi)栽培品種來源相近，種質(zhì)交流受地域限制，這可能是由于大花三色堇的優(yōu)良品種多為歐美、德國和日本等國研發(fā)，這些國家為了保護(hù)自身利益，限制了國際間的流通品種而造成的。為滿足我國大花三色堇的市場(chǎng)需求，必須加快大花三色堇新品種選育的步伐。研究中還發(fā)現(xiàn)，花色與品系是影響大花三色堇遺傳距離的重要因素，尤以花色最為明顯，故可以推測(cè)不同花色的遺傳基礎(chǔ)是不同的。