潘天旭，張宇鵬，趙家慧，楊祥波

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，生物與制藥工程學(xué)院，吉林吉林 132101）

眾所周知“泰國香米出福水，中國香米出五?！?，而五常大米中最負(fù)盛名，最受人們歡迎的品種便是“稻花香2號”，因為黑龍江省五常市得天獨厚的地理位置，使之在水質(zhì)好、晝夜溫差大、積溫高的良好生態(tài)環(huán)境中得以產(chǎn)出，稻米采夏日驕陽之精華，集寒帶黑土之肥沃，口味口感、營養(yǎng)價值遠(yuǎn)高于其他稻米品種[1]，“稻花香2號”與南方兩熟甚至三熟的水稻相比，每年僅能產(chǎn)出一次稻谷，并且稻米產(chǎn)量也僅有其他水稻品種的三分之一，因其高品質(zhì)稀有等特點使之在高端市場不僅頗受人們青睞，而且價格較普通稻米高出數(shù)倍，正因如此成為一些不法商家謀取不法利益的對象，市面上摻假“稻花香2號”種子現(xiàn)象不斷出現(xiàn)，農(nóng)戶挑選種子時稍有不慎，就會損失慘重，農(nóng)戶家傾注一年的心血也將付諸東流，也使國家在知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)和品種管理上面對面臨巨大的挑戰(zhàn)，因此研究出一種準(zhǔn)確高效的品種鑒定技術(shù)，進(jìn)行對水稻產(chǎn)業(yè)的摻假和售假現(xiàn)象加以監(jiān)督和管理迫在眉睫[2]。

傳統(tǒng)的品種鑒定根據(jù)稻谷的形態(tài)學(xué)性狀和特點進(jìn)行鑒定區(qū)分，但此方法鑒定周期長，誤差較大，更容易受環(huán)境因素的影響，真實性較低，不能滿足種子管理部門高效準(zhǔn)確的新要求。而DNA分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)運而生便可以克服傳統(tǒng)形態(tài)鑒定的缺點[3-4]，其中SSR（simple sequence repeats）技術(shù)是近幾年來發(fā)展起來的建立在PCR基礎(chǔ)上的 第二代DNA 分子標(biāo)記技術(shù)，因為此鑒定方法用友快速，穩(wěn)定，操作簡單，成本低的優(yōu)點，在水稻種子真?zhèn)螜z測起到了不可替代的作用[5-6]。由此技術(shù)建立的“稻花香2號”SSR-PCR反應(yīng)體系在品種鑒別上提供經(jīng)濟(jì)，省時，準(zhǔn)確的研究基礎(chǔ)，在保護(hù)此品種的知識產(chǎn)權(quán)和育種研究者的權(quán)益意義重大。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗材料選取為 “稻花香2號”和其親本“五優(yōu)稻1號”均由 黑龍江省五常水稻所提供，在恒溫30℃光照培養(yǎng)箱培育5d獲得。

1.1.1 引物

選取農(nóng)業(yè)部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（NY/T 1433-2014）中的48對引物中篩《水稻品種鑒定技術(shù)規(guī)程：SSR標(biāo)記》（2014 年 6 月 1日實施）中 8對 SSR引物[7]。

表1 8個水稻 SSR標(biāo)記引物的基本信息

1.1.2 實驗試劑

（1）plant DNA so 植物基因組快速提取試劑盒（品牌：vastar）；

（2）nastar PCR mix（品牌：vastar）；

以上試劑均選自于長春市華程生物技術(shù)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA提取

選取幼苗期水稻葉片100g，用剪刀剪碎放入研缽中，用液氮充分研磨成粉末快速移入2ml移液管中后，用plant DNA so植物基因組快速提取試劑盒提取水稻全基因組DNA，詳細(xì)方法見此試劑盒說明書，提取后的DNA再用紫外分光光度計檢測質(zhì)量濃度，加入適量0.1×TE溶液稀釋成一定濃度并在-20℃冰箱中保存。

1.2.2 PCR反應(yīng)體系優(yōu)化設(shè)計

10μL的反應(yīng)體系，用模板 DNA 濃度、引物濃度、2×PCR mix 用量（由Taq DNA Polymerase mg2+，dNTPs 以及PCR穩(wěn)定劑和增強(qiáng)劑的混和體系）作為影響因素，以 L16（43）正交試驗設(shè)計優(yōu)化方案（表2），共 16個處理方案，重復(fù)三次。PCR擴(kuò)增程序為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性45s；55℃退火30s；共35個循環(huán)；72℃延伸7min。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)條帶的有無，清晰度及亮度篩選出最優(yōu)的反應(yīng)體系。

表2 SSR反應(yīng)體系的正交試驗設(shè)計

1.2.3 電泳檢測

先用4%的瓊脂糖凝膠電泳檢測8對SSR引物擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性，篩選出其中多態(tài)性高的擴(kuò)增產(chǎn)物，再用6% SDS變性聚丙烯凝膠電泳分離。電泳結(jié)束后，首先進(jìn)行冰醋酸（10%）固定20min，硝酸銀溶液（2%）染色30min，ddH2O迅速漂洗5～10s，用顯色液（3%無水碳酸納溶液）顯色10～15min，ddH2O漂洗1～5min，室溫環(huán)境中自然晾干，拍照，觀察并記載帶型，統(tǒng)計結(jié)果數(shù)據(jù)。

1.2.4 結(jié)果判定

根據(jù)農(nóng)業(yè)部稻米及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心制定標(biāo)準(zhǔn)[7]得知：兩個品種進(jìn)行變性聚丙烯凝膠電泳后的條帶存在兩個或兩個以上的位點差異時，表明為不同的品種，當(dāng)僅有一個位點存在差異時，表明為相似品種，若所有位點均相同，則為同一品種。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取的質(zhì)量

品種真?zhèn)蔚蔫b定準(zhǔn)確性受DNA的質(zhì)量影響較大，用紫外分光光度計檢測OD260 /OD280 值應(yīng)該在1.8～2.0之間，說明DNA質(zhì)量高，純度高，若OD260 /OD280值小于1.8或大于2.0，說明DNA 質(zhì)量不佳，可能其中含有RNA或蛋白質(zhì)。表2 的 DNA 提取結(jié)果顯示，提取的 DNA 質(zhì)量較高，完全符合PCR擴(kuò)增的要求。

表3 DNA質(zhì)量檢測結(jié)果

2.2 PCR反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果分析

如圖1所示，泳道1～4在2×PCR mix 的濃度比較低反應(yīng)體系中擴(kuò)增出的條帶十分模糊，其余12條泳道均有明顯的條帶，并整體上隨著 2×PCR mix 的用量的增加條帶亮度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，并在6μl時最為清晰穩(wěn)定，說明此試劑最適用量為6μl。在由9～12泳道可明顯發(fā)現(xiàn)隨著引物濃度的增加條帶亮度增加，逐漸清晰，說明引物在設(shè)計濃度范圍內(nèi)，較高濃度的引物有利于PCR反應(yīng)擴(kuò)增，模板DNA的用量在15～35之間均能產(chǎn)生較為清晰的條帶，在此范圍內(nèi)對結(jié)果影響不大，從經(jīng)濟(jì)節(jié)約的角度考慮，以及高濃度的引物會導(dǎo)致引物二聚體的現(xiàn)象增加，影響試驗結(jié)果，最終確定反應(yīng)體系；引物0.8μmol·L-1，模板8ng，2×PCR mix 6μl。并且由此反應(yīng)體系擴(kuò)增的第11泳道的條帶亮度最好，最清晰。

圖1 PCR正交試驗擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.3 SSR 引物的篩選

為了試驗的準(zhǔn)確性，本研究共利用8對引物在“稻花香2號”及其親本“五優(yōu)稻1號”進(jìn)行初篩和重復(fù)性驗證，均能擴(kuò)增到清晰條帶，但部分在親本間沒有明顯差異，無多態(tài)性。最后確定引物RM366和引物RM297在親本和雜種F1中存在擴(kuò)增的譜帶 單一清晰，存在多態(tài)性（圖3），適合用于此品種的真實性檢測。

圖2 8對引物對“稻花香2號”及“五優(yōu)稻1號”多態(tài)性篩選結(jié)果

3 結(jié)論與討論

該研究從NY/T 1433-2014《水稻品種鑒定技術(shù)規(guī)程：SSR標(biāo)記法》推薦適合東北粳稻的8對引物中篩選出2對可快速準(zhǔn)確鑒定出“稻花香2號”的真實性，并且在試驗中采用10 μl的反應(yīng)體系，使引物和其他藥品的用量大大減少，降低了檢測費用；摸索出一套與品種和引物相適應(yīng)的PCR反應(yīng)條件，保證實驗室檢測結(jié)果的穩(wěn)定性、重演性、準(zhǔn)確性，真正為農(nóng)業(yè)主管部門、執(zhí)法部門提供最快速、最有利科學(xué)的鑒定技術(shù)。

為水稻品種真實性鑒定室內(nèi)分子檢測方法提供了判定依據(jù)，也能為農(nóng)業(yè)行政執(zhí)法部門開展執(zhí)法工作以及種子市場監(jiān)管工作提供相應(yīng)的技術(shù)支撐，減少假劣種子進(jìn)入市場的概率，促進(jìn)黑龍江種業(yè)健康、有序、可持續(xù)發(fā)展。