謝莉莉 廖天安 謝 奇 鄧 旎

(海南省人民醫(yī)院口腔科，海口570102)

口腔鱗狀細(xì)胞癌(Oral squamous cell carcinoma，OSCC)發(fā)病率在口腔癌癥中占90%，由于預(yù)后不良，OSCC是世界范圍內(nèi)致死率較高的癌癥之一[1]。營(yíng)養(yǎng)缺乏、食用富含亞硝胺或霉菌毒素的食物和低社會(huì)經(jīng)濟(jì)地位可能會(huì)導(dǎo)致OSCC發(fā)生[2]。盡管治療方案不斷完善，但OSCC的5年生存率仍低于60%。除了分化和腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(Tumor lymph node metastasis，TNM)分期之外，幾乎沒(méi)有任何預(yù)測(cè)因子可以預(yù)測(cè)OSCC患者的預(yù)后。在這種情況下，確定潛在的分子標(biāo)記和靶點(diǎn)是預(yù)測(cè)OSCC患者5年總生存期(Overall survival，OS)和無(wú)復(fù)發(fā)生存期(Relapse-free survival，RFS)的重要前提[3]。

同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白激酶-2(Homeodo-main-interacting protein kinase-2，HIPK2)是一種能夠影響細(xì)胞增殖、凋亡、分化的腫瘤抑制因子[4]。既往研究已經(jīng)證明HIPK2介導(dǎo)促進(jìn)成纖維細(xì)胞形成、腎小管上皮細(xì)胞凋亡和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，這意味著它可能是抗纖維化治療的潛在靶標(biāo)[5]。HIPK2也被證明在嚴(yán)重DNA損傷后通過(guò)與第46位絲氨酸的直接結(jié)合和磷酸化來(lái)激活p53蛋白[6]。Donninger等[7]證實(shí)HIPK2是化療藥物順鉑治療中調(diào)節(jié)p53活性的重要因子。Reuven等[8]指出HIPK2敲除可誘導(dǎo)多種抗癌藥物(包括多柔比星和順鉑)的耐藥性。HIPK2介導(dǎo)的波形蛋白表達(dá)下調(diào)可能有助于抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲[9]。然而，目前關(guān)于HIPK2在OSCC中的生物學(xué)作用和臨床意義仍然大部分未知。在本研究中，我們研究了136例OSCC隊(duì)列中腫瘤細(xì)胞的HIPK2表達(dá)情況，并確定了其表達(dá)與OSCC的臨床病理因素、復(fù)發(fā)和預(yù)后的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1研究人群 本研究納入2003～2011年期間在海南省人民醫(yī)院口腔頜面外科接受治療的93例男性和43例女性O(shè)SCC患者。TNM分類(lèi)參照2002年國(guó)際癌癥控制聯(lián)盟標(biāo)準(zhǔn)(UICC2002)。根據(jù)2005年修訂的世界衛(wèi)生組織腫瘤分類(lèi)要求，病理學(xué)檢查由2名病理學(xué)家獨(dú)立進(jìn)行。

1.2免疫組化檢測(cè) 將石蠟包埋組織以4 μm厚度切片，脫蠟，水化并用過(guò)氧化氫去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。HIPK2染色程序基于試劑盒說(shuō)明書(shū)。經(jīng)熱抗原修復(fù)后，將切片與1∶200稀釋的小鼠單克隆抗人HIPK2抗體在4℃孵育過(guò)夜，然后與EnVision HRP-IgG二抗溫育30 min。使用3,3′-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色，蘇木素復(fù)染。由2名口腔病理學(xué)家(對(duì)患者的臨床病理學(xué)數(shù)據(jù)不知情)使用TMA軟件模塊1.15.2(匈牙利3DHISTECH公司)的半定量評(píng)分系統(tǒng)獨(dú)立分析并打分。量化強(qiáng)度為陰性、弱、中等、強(qiáng)烈，分別計(jì)0、1、2、3分。免疫陽(yáng)性細(xì)胞的比例定量如下：陰性為0；<10%為1；10%～50%為2；51%～80%為3；>80%為4。通過(guò)將細(xì)胞的染色強(qiáng)度和比例分?jǐn)?shù)相乘得到0～12的分?jǐn)?shù)來(lái)確定最終的免疫反應(yīng)性評(píng)分。記錄每個(gè)病例的綜合免疫反應(yīng)評(píng)分的平均值。基于免疫反應(yīng)性評(píng)分值，HIPK2評(píng)分為低(0～4分)、中(5～8分)、高(9～12分)[10]。整個(gè)切片在組織微陣列染色不典型代表的條件下重復(fù)操作。在每次實(shí)驗(yàn)期間設(shè)無(wú)一抗的陰性對(duì)照。

1.3數(shù)據(jù)分析 計(jì)算OSCC患者的5年總生存期(OS)和無(wú)復(fù)發(fā)生存期(RFS)。OS被定義為從隨機(jī)化開(kāi)始至因任何原因引起死亡的時(shí)間。RFS被定義為從入院到淋巴結(jié)局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的時(shí)間。所有統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件，HIPK2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系采用線(xiàn)性相關(guān)性檢驗(yàn)(年齡、分化程度、T分期、N分期和臨床分期)和Pearsonχ2檢驗(yàn)(性別、是否吸煙、是否飲酒和腫瘤位置)，使用Kaplan-Meier方法評(píng)估患者存活并使用Log-Rank檢驗(yàn)進(jìn)行比較，使用存活數(shù)據(jù)進(jìn)行單變量和多變量Cox回歸分析，使用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較以分析不同HIPK2表達(dá)程度的平均OSCC存活時(shí)間，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1HIPK2表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系 在136例OSCC患者中，HIPK2低表達(dá)49例(36.3%)，中表達(dá)53例(38.8%)，高表達(dá)34例(24.9%)，見(jiàn)圖1?；颊叩闹形荒挲g為60歲(24～85歲)，隨訪(fǎng)時(shí)間平均為3.58年。分析表明，OSCC中HIPK2的表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P<0.001)，但與性別、年齡分布、是否吸煙、是否飲酒、分化程度、腫瘤部位、T分期、臨床分期無(wú)顯著關(guān)系(P>0.05)，見(jiàn)表1。值得注意的是，HIPK2與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的相關(guān)性提示HIPK2在增加OSCC的侵襲和轉(zhuǎn)移中具有潛在作用。

2.2OSCC患者HIPK2表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系 為了確定HIPK2表達(dá)是否可能是OSCC的預(yù)后預(yù)測(cè)因子，我們通過(guò)Kaplan-Meier分析和LogRank檢驗(yàn)檢查了136例OSCC患者中的HIPK2表達(dá)水平和臨床隨訪(fǎng)信息。在隨訪(fǎng)期間有63例患者死亡，而73例患者在隨訪(fǎng)結(jié)束時(shí)仍然存活。單因素分析見(jiàn)表2，臨床病理參數(shù)如N分期、臨床分期和HIPK2表達(dá)與5年OS相關(guān)(P<0.05)，而T分期、臨床分期和HIPK2表達(dá)與5年RFS有關(guān)(P<0.05)。多因素分析顯示T分期、N分期、臨床分期和HIPK2表達(dá)是OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，HIPK2表達(dá)是復(fù)發(fā)的最重要危險(xiǎn)因素(表2、3，圖2)。結(jié)果顯示，HIPK2高水平表達(dá)的患者中位總生存時(shí)間明顯低于HIPK2低水平表達(dá)患者(P<0.001)和HIPK2中水平表達(dá)患者(P<0.001)。此外，HIPK2低表達(dá)組(P<0.001)和HIPK2中表達(dá)組(P<0.001)的中位無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間與HIPK2高表達(dá)組相比均顯著升高。這些結(jié)果表明，HIPK2高水平表達(dá)患者的預(yù)后比低水平HIPK2表達(dá)的患者更差(表4)。

圖1 HIPK2蛋白在OSCC組織中的免疫組化染色(DAB顯色，×400)Fig.1 Immunohistochemistry of HIPK2 protein in OSCC tissues(DAB staining,×400)Note: A.Negative expression in normal oral mucosa;B.Low expression in cytoplasm；C.Medium expression in cytoplasm；D.High expression in cytoplasm.

表1 HIPK2表達(dá)與OSCC臨床病理特征的關(guān)系

Tab.1 Correlation between expression of HIPK2 and clinicopathological features of OSCC

Clinicalpathological featuresSubgroupsnHIPK2 staining valueLow expression(n=49)Medium expression(n=53)High expression(n=34)P valueSexMale9432(34.0%)37(39.4%)25(26.6%)0.272Female4218(42.4%)16(37.6%)8(20.0%)Age(year)<606625(37.9%)25(37.9%)16(24.2%)0.612≥607024(34.3%)28(40.0%)18(25.7%)SmokingYes6623(34.8%)25(37.9%)18(27.3%)0.835No7026(36.9%)28(39.7%)16(23.4%)DrinkingYes6522(33.8%)25(38.5%)18(27.7%)0.464No7127(38.0%)28(39.4%)16(22.6%)Tumor DifferentiationHigh10036(36.0%)41(41.0%)23(23.0%)0.298Medium3211(34.4%)11(34.4%)10(31.2%)low41(25.0%)1(25.0%)2(50.0%)Tumor siteGingiva268(30.8%)10(38.4%)8(30.8%)0.227Tongue6525(38.5%)23(35.4%)17(26.1%)Buccal3013(42.6%)12(39.4%)5(18.0%)Other1)153(20.0%)8(53.3%)4(26.7%)T stageT1-T29334(36.5%)37(39.8%)22(23.7%)0.625T3-T44315(34.9%)16(37.2)12(27.9%)N stageN09136(39.5%)41(45.1%)14(15.4%)<0.001N1-N34513(28.9%)12(26.7%)20(44.4%)Clinical stageⅠ-Ⅱ7127(38.0%)30(42.3%)14(19.7%)0.084Ⅲ-Ⅳ6522(33.8%)23(35.4%)20(30.8%)

Note：1)Others included hard palate,oropharynx and lips.

表2 OSCC患者OS和RFS的選擇特征的單因素分析

Tab.2 Univariate analysis of selective characteristics of OS and RFs in OSSC patients

CharacteristicsSubgroups5-years OS(95%CI)P value5-years RFS(95%CI)P valueT stageT1-T20.409(0.261-0.569)0.2210.649(0.538-0.764)0.035T3-T40.248(-0.098-0.596)0.713(0.450-0.981)N stageN00.469(0.289-0.649)<0.0010.667(0.548-0.794)0.584N1-N30.252(-0.101-0.605)0.733(0.620-0.841)Clinical stageⅠ-Ⅱ0.442(0.251-0.622)0.0110.627(0.498-0.749)0.041Ⅲ-Ⅳ0.298(0.049-0.560)0.727(0.527-0.927)HIPK2 staining valueLow expression0.474(0.271-0.676)<0.0010.701(0.558-0.839)0.002Medium expression0.608(0.502-0.725)0.795(0.708-0.881)High expression0.162(0.072-0.248)0.330(0.133-0.793)

表3 多因素COX回歸分析OSCC存活因素

Tab.3 Multivariate COX regression analysis on factors for OSCC survival

Characteristics5-years OSHazard ratio(95%CI)P value5-years RFSHazard ratio(95%CI)P valueT stageT1-T2 vs.T3-T40.547(0.331-0.904)0.0191.188(0.483-2.923)0.707N stageN0 vs.N1-N30.238(0.143-0.398)<0.0010.614(0.280-1.347)0.223Clinical stageⅠ-Ⅱ vs.Ⅲ-Ⅳ2.503(1.348-4.649)0.0042.249(0.865-5.852)0.097HIPK2 staining valueLow vs.High0.197(0.123-0.315)<0.0010.451(0.239-0.849)0.014Medium vs.High0.271(0.174-0.422)<0.0010.371(0.192-0.714)0.003

表4 多重比較HIPK2表達(dá)強(qiáng)度的中位OSCC存活時(shí)間

Tab.4 Multiple comparison with median OSCC survival time of HIPK2 staining value

HIPK2 staining value5-years OSMedian time(range)(months)P value5-years RFSMedian time(range)(months)P valueLow expression43(4-93)<0.00139(2-93)<0.001Medium expression38(2-81)<0.0011)36(2-59)<0.001High expression14(2-56)11(1-54)

圖2 不同HIPK2表達(dá)強(qiáng)度OSCC患者OS和RFS的Kaplan-Meier曲線(xiàn)Fig.2 Kaplan-Meier curves of 5-years overall survival(OS)and recurrence-free survival(RFS)in OSCC patients with different HIPK2 expression intensity

3 討論

本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)方法研究了136例OSCC組織中HIPK2的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HIPK2在OSCC組織中表達(dá)較其相鄰的非癌組織相對(duì)顯著上調(diào)，這個(gè)結(jié)果與以往研究的膀胱癌、乳腺癌和卵巢癌中HIPK2表達(dá)情況一致[11,12]。HIPK2是一種核絲氨酸/蘇氨酸激酶，作為轉(zhuǎn)錄因子的共抑制因子，是HIPK家族的四種多功能激酶之一，它們是各種細(xì)胞外刺激的傳感器。這些激酶控制關(guān)鍵的細(xì)胞功能，如調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的下游效應(yīng)子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、胚胎發(fā)育、DNA損傷反應(yīng)和細(xì)胞增殖[13]。因此，HIPK2參與致癌作用。HIPK2過(guò)表達(dá)在家族性腺瘤性息肉病的宮頸癌和結(jié)直腸癌患者中得到證實(shí)[14]。目前的研究表明，HIPK2表達(dá)與OSCC組織中的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床病理特征顯著相關(guān)。這些結(jié)果表明HIPK2是一種潛在的預(yù)后新指標(biāo)，可能是與轉(zhuǎn)移相關(guān)的候選腫瘤抑制因子，可以作為OSCC患者的潛在治療靶點(diǎn)。

多項(xiàng)研究證實(shí)了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移在侵襲性惡性腫瘤中的作用，早期發(fā)生區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是癌癥進(jìn)展的關(guān)鍵步驟。本研究提供的數(shù)據(jù)表明OSCC細(xì)胞表達(dá)的HIPK2可能在OSCC轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用，與其他組相比，具有HIPK2高表達(dá)的OSCC患者的生存時(shí)間顯著縮短并且淋巴結(jié)受累增多。目前已有大量證據(jù)表明HIPK2在扁桃體鱗狀細(xì)胞癌(Tonsillar squamous cell carcinoma,TSCC)、口咽部鱗狀細(xì)胞癌(Oropharynx squamous cell carcinoma,OHSCC)、乳腺癌、胃癌、非小細(xì)胞肺癌和食管鱗狀細(xì)胞癌中與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)，而HIPK2在OSCC組織中轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制尚不清楚[15]。最新研究發(fā)現(xiàn)，HIPK2的上調(diào)抑制上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)了食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的遷移和侵襲，其作用機(jī)制與降低間充質(zhì)標(biāo)志物N-鈣黏蛋白mRNA的水平和增加上皮標(biāo)志物E-鈣黏蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞與基質(zhì)相互作用，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性和侵襲性改變有關(guān)[9]。Tan等[16]也證明HIPK2敲除可增加N-鈣黏蛋白和纖連蛋白的水平，并降低E-鈣黏蛋白的水平，表明上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生是HIPK2下調(diào)誘導(dǎo)的。因此，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能是HIPK2高表達(dá)的OSCC患者預(yù)后不良的重要原因。為了闡明HIPK2表達(dá)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞淋巴結(jié)擴(kuò)散的機(jī)制，有必要通過(guò)進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究來(lái)闡明HIPK2在OSCC中的作用機(jī)制。

近年來(lái)，大量學(xué)者一直致力于提供對(duì)OSCC預(yù)后信息準(zhǔn)確的分子生物學(xué)標(biāo)志物。雖然已有研究報(bào)道HIPK2作為頭頸部腫瘤患者總生存預(yù)后生物標(biāo)志物的潛在作用，但只有兩項(xiàng)研究提出問(wèn)題并得到一致的結(jié)論：HIPK2高表達(dá)與TSCC和OHSCC患者總生存率較差相關(guān)，而與RFS的關(guān)系尚不清楚[17]。Zhang等[9]觀察到腫瘤細(xì)胞質(zhì)HIPK2表達(dá)與乳腺癌無(wú)復(fù)發(fā)生存率較差有關(guān)。在小細(xì)胞肺癌中，HIPK2陰性腫瘤患者的RFS較高，隨訪(fǎng)較好[18]。目前，對(duì)于所有頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者，HIPK2表達(dá)與RFS的關(guān)系尚不清楚。本研究首次描述HIPK2表達(dá)與OSCC患者OS和RFS關(guān)系，將有助于明確HIPK2的生物學(xué)功能與OSCC發(fā)展之間的潛在作用。研究結(jié)果顯示，HIPK2低、中表達(dá)組的中位無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間均比HIPK2高表達(dá)組顯著降低，并且以高HIPK2表達(dá)組為參考，低、中HIPK2表達(dá)組5年OS和5年RFS的相對(duì)危險(xiǎn)度均顯著降低。這些結(jié)果表明，HIPK2高水平表達(dá)患者的預(yù)后比中、低水平HIPK2表達(dá)的患者更差。

總之，本研究的結(jié)果表明HIPK2蛋白表達(dá)水平可作為OSCC的獨(dú)立預(yù)后標(biāo)記物。HIPK2蛋白表達(dá)增加及其與OSCC預(yù)后差、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性為其在OSCC的發(fā)生和進(jìn)展中的作用提供了證據(jù)。進(jìn)一步研究HIPK2與其他潛在基因或環(huán)境危險(xiǎn)因素相互作用是十分必要的，這將有助于闡明HIPK2在OSCC發(fā)病機(jī)制中的復(fù)雜作用。