曲冰杰 郭劍穎 王宏偉

(北京懷柔醫(yī)院病理科，北京101400)

膿毒癥發(fā)病涉及感染、炎癥、免疫、凝血及組織損傷等諸多病理過程，其中抗炎狀態(tài)/免疫抑制引發(fā)的免疫功能障礙是造成膿毒癥發(fā)生的重要機制。最近研究顯示，樹突細胞(Dendritic cells,DCs)數(shù)量減少及功能低下在膿毒癥免疫抑制中發(fā)揮著重要作用[1]，但在膿毒癥免疫抑制中是否存在DCs的異常分化并影響T細胞功能仍未完全闡明。本研究以臨床膿毒癥患者為研究對象，研究膿毒癥患者外周血DCs的分化及免疫表型變化特點，進一步探討調節(jié)性DCs(Regulatory DCs，DCregs)誘導膿毒癥免疫功能障礙的病理學機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1臨床資料 收集重癥監(jiān)護病房臨床確診的膿毒癥患者10例(男6例，女4例，平均年齡48±8.6歲)，健康對照組10例(男女各5例，平均年齡45±7.5歲)。膿毒癥組患者根據(jù)病程分為膿毒癥早期(1～2 d)和膿毒癥后期(7～8 d)兩個階段。

1.1.2標本收集 無菌操作抽取膿毒癥組及對照組靜脈血5 ml于EDTA-Na2抗凝管中，立即輕搖混勻，室溫保存，6 h內(nèi)進行測定。

1.1.3試劑及儀器 鼠抗人單克隆抗體包括Lin-1-FITC、CD33-PE、HLA-DR-Percp、PD-L1-APC、CD123-PE、CD3-Percp、CD4-FITC、CD8-PE、PD-1-APC及同型對照、FACS 溶血素、紅細胞裂解液及BD-FACS Calibur流式細胞分析儀均購自美國BD公司。

1.2方法 流式細胞術檢測：各組患者取150 μl血液樣本加入適量肝素抗凝，DCs表型檢測時加入Lin-1-FITC、CD33-PE、CD123-PE、HLA-DR-Percp、PD-L1-APC抗體2～5 μl，混勻后室溫避光孵育30 min，離心、洗滌后重懸細胞，如圖1A標記單個核細胞，并應用設門法分別標記Lin-單個核細胞、Lin-CD33+HLA-DR+、Lin-CD33+PD-L1+髓系DCs和Lin-CD123+HLA-DR+、Lin-CD123+PD-L1+類漿系DC(圖1B～F)；T細胞表型檢測時加入CD3-Percp、CD4-FITC、CD8-PE、PD-1-APC抗體2～5 μl，混勻后室溫避光孵育30 min，加入2 ml 的紅細胞裂解液，室溫避光孵育8 min，離心、洗滌后重懸細胞，如圖2應用設門法標記出CD4+(圖2A)和CD8+(圖2B)T細胞，CD4+PD-1+(圖2C)和CD8+PD-1+(圖2D)T細胞。采用FlowJo軟件進行數(shù)據(jù)分析。DCs亞群HLA-DR和PD-L1表達檢測采用平均熒光強度(Mean fluorescence intensity,MFI)計算數(shù)值，T細胞亞群PD-1表達變化采用陽性細胞占單個核細胞的比例計算數(shù)值。

圖1 DCs亞群表達HLA-DR和PD-L1流式細胞術檢測Fig.1 Expression of HLA-DR and PD-L1 in DCs subsets by flow cytometryNote: A.Gating peripheral blood mononuclear cells according to cell particle and size;B.The left quadrant of sets the door to Lin-mononuclear cells;C.The right upper quadrant of sets the door to Lin-CD33+HLA-DR+DCs;D.The right middle and upper quadrant of sets the door to Lin-CD33+PD-L1+DCs;E.The right upper quadrant of sets the door to Lin-CD123+HLA-DR+DCs;F.The right middle upper quadrant of sets the door to Lin-CD123+PD-L1+DCs.

圖2 T細胞亞群及PD-1表達流式細胞術檢測Fig.2 Detection of T cell subsets and PD-1 expression by flow cytometryNote: A.In the right middle and upper quadrant of CD4+T cells were gated in CD3+T cells;B.In the right upper quadrant of CD8+T cells were gated in CD3+T cells;C.In the right middle and upper quadrant of CD4+PD-1+T cells were gated in CD4+T cells;D.The right middle and upper quadrant of sets the gate of CD8+PD-1+T cells in CD8+T cells.

2 結果

2.1外周血DCs亞群HLA-DR和PD-L1表達 膿毒癥早期和后期Lin-CD33+HLA-DR+髓系DCs持續(xù)下降，且均與對照組有顯著差異(P<0.05)，而Lin-CD33+PD-L1+髓系DCs在膿毒癥早期和后期持續(xù)升高，并且后期顯著高于對照組(P<0.05)；膿毒癥早期和后期Lin-CD123+HLA-DR+類漿系DCs也呈持續(xù)下降，在后期顯著低于對照組(P<0.05)；Lin-CD123+PD-L1+類漿系DCs在膿毒癥早期先顯著高于對照組(P<0.05)，而在后期較早期出現(xiàn)顯著下降(P<0.05)(表1)。

2.2外周血T細胞亞群比例及PD-1表達 膿毒癥患者早期及后期CD4+/CD8+T細胞亞群比例均較對照組顯著降低(P<0.05)，并且后期較早期進一步下降，但無顯著差異(P>0.05)。膿毒癥患者早期和后期CD4+T細胞PD-1表達均較對照組升高，但無顯著差異(P>0.05)，而膿毒癥患者CD8+T細胞PD-1表達在早期較對照組升高(P>0.05)，后期則進一步升高且顯著高于對照組(P<0.05)及膿毒癥早期(P<0.05)(表2)。

表1 DCs亞群HLA-DR和PD-L1表達變化(單位:平均熒光強度，MFI)

Tab.1 Changes of HLA-DR and PD-L1 expression in DCs subsets(unit:average fluorescence intensity，MFI)

DCs phenotypeGroupsLin-CD33+HLA-DR+Lin-CD33+PD-L1+Lin-CD123+HLA-DR+Lin-CD123+PD-L1+Control group772±209 262±38250±11376±6Early sepsis(1-2 d)453±1211)303±126168±62 259±1291)Late sepsis(7-8 d)356±1351) 409±1131)86±411) 86±212)

Note：Compared with the control group,there was a significant difference,1)P<0.05;compared with the early stage of sepsis,there was a significant difference,2)P<0.05.

表2 T細胞亞群比例及PD-1表達變化

Tab.2 Proportion of T cell subsets and PD-1 expression

T cell phenotypeGroupsCD4+/CD8+ ratioCD4+PD-1+/CD3+(%)CD8+PD-1+/CD3+(%)Control group(n=10)1.21±0.3110.25±3.1110.76±5.64Early sepsis(1-2 d)(n=10)0.80±0.201)12.63±5.7012.69±4.10Late sepsis(7-8 d)(n=10)0.69±0.331)12.88±6.4718.58±4.611)2)

Note：Compared with the control group,there was a significant difference,1)P<0.05;compared with the early stage of sepsis,there was a significant difference,2)P<0.05.

3 討論

膿毒癥是臨床上常見的致死原因之一，是機體對于感染所表現(xiàn)的一種失控的自主反應，最終導致多器官功能障礙衰竭及死亡。臨床研究發(fā)現(xiàn)，在膿毒癥的發(fā)病過程中，機體不是一直處于過度炎癥反應狀態(tài)，而在病程后期，機體存在顯著的免疫抑制[2]。

DCs是膿毒癥發(fā)病機制中重要的免疫細胞學因素，DCs數(shù)量減少與膿毒癥臨床預后不良密切相關，是發(fā)生多器官功能障礙綜合征甚至死亡的重要原因之一[3]。通過前期相關研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥免疫紊亂中 DCs 的變化和作用，包括DCs 數(shù)量減少、大量 DCs 發(fā)生凋亡、成熟活化的 DCs 數(shù)量明顯減少等，影響 DCs 抗原提呈和刺激 T 淋巴細胞增殖活化的免疫功能，這些都將導致膿毒癥后期免疫抑制的發(fā)生[4]。本研究結果進一步顯示，膿毒癥患者外周血不僅DCs總量減少，而且Lin-CD33+HLA-DR+髓系DCs和Lin-CD123+HLA-DR+類漿系DCs亞群在后期也均出現(xiàn)數(shù)量明顯減少，說明髓系及類漿系DCs數(shù)量減少及免疫功能下降與膿毒癥后期免疫抑制狀態(tài)存在相關性。

充分活化T細胞需要雙信號識別，除特異性抗原肽/TCR組成的第一信號外，還需要多種共刺激分子參與提供第二信號。第二信號的缺乏，會導致T細胞的無反應性或特異性免疫耐受[5]。負性共刺激分子的表達則抑制T細胞活化，對外周免疫耐受的形成發(fā)揮關鍵性作用[6]。PD-L1 和 PD-1 作為負性共刺激分子，它的后期表達持續(xù)增高，提示DCregs的分化[7]。DCregs是DCs的一個新的亞群，作為具有負性調控作用DCs的總稱，DCregs能誘導調節(jié)性T細胞(Regulatory T cells，Tregs)生成。DCregs具有特殊免疫表型CD11b+CD11c+DCs，能促進調節(jié)性T細胞的增殖，抑制免疫應答[8]。DCregs還能產(chǎn)生負性調控細胞因子，如IL-10或TGF-β，直接抑制效應T細胞的活性或改變T輔助細胞的極化，通過TGF-β1抑制效應性T細胞活化，還能誘導調節(jié)性T細胞增殖或T細胞失活[9，10]。本研究結果顯示，膿毒癥患者髓系DCs 表達PD-L1持續(xù)升高而HLA-DR持續(xù)下降，類漿系DCs在膿毒癥早期PD-L1表達升高而HLA-DR表達持續(xù)下降，此時提示出現(xiàn)了DCregs的分化特征；同時，膿毒癥患者早期及后期CD4+/CD8+T細胞亞群比例均較對照組顯著降低，特別是CD8+T細胞在膿毒癥后期表達PD-1顯著升高，說明T細胞免疫功能下降，可能導致調節(jié)性T細胞的分化，進一步抑制免疫功能。膿毒癥發(fā)病過程中，抗原提呈細胞會出現(xiàn)DCregs的分化，T細胞隨之出現(xiàn)Tregs的分化，二者在膿毒癥免疫抑制中可能發(fā)揮重要作用。

PD-1/PD-L1 是免疫抑制性受體-配體。PD-1/PD-L1通路對Treg發(fā)揮重要的抑制作用[11]。免疫細胞受到刺激后，CD4+和CD8+T 淋巴細胞表面PD-1表達會增加以防止T 淋巴細胞過度活化[12]。PD-L1可單獨誘導初始CD4+T細胞轉化為Tregs，PD-L1表達上調，可促進 Tregs發(fā)揮免疫抑制作用[13]。PD-1/PD-L1通路的激活可抑制Th1細胞增殖，減少IFN-γ和Th1型細胞因子分泌，影響Th1/Th2分化。PD-1/PD-L1 通過抑制T細胞功能，發(fā)揮負向調節(jié)作用，從而誘導免疫抑制。本研究膿毒癥患者CD4+T細胞和CD8+T細胞表達PD-1升高，特別是CD8+T細胞PD-1表達在膿毒癥后期顯著升高，提示膿毒癥中PD-1/PD-L1通路活化抑制了T細胞的免疫應答功能，進一步可能導致DCregs的分化，提示膿毒癥后期進入了不可逆的免疫抑制狀態(tài)?？傊?，在膿毒癥發(fā)病過程中，DCregs分化可能導致T細胞免疫功能下降并誘導Tregs分化，PD-1/PD-L1通路負性免疫調節(jié)作用在DCregs和Tregs的分化中發(fā)揮作用，參與了膿毒癥免疫抑制的發(fā)生過程。通過調控負性共刺激分子PD-1及其主要配體PD-L1的表達及DCregs分化將開辟膿毒癥防治的新方向。