齊 奧 付宜鳴 倪少濱

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院,哈爾濱150001)

膀胱癌是我國(guó)泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，具有術(shù)后易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)，術(shù)后五年復(fù)發(fā)率可達(dá)50%～70%，根據(jù)CA Cancer J Clinic報(bào)道其復(fù)發(fā)所導(dǎo)致的高額治療費(fèi)用位于所有實(shí)體腫瘤之首[1-3]。導(dǎo)致膀胱癌復(fù)發(fā)的主要因素為術(shù)后腫瘤殘余以及游離腫瘤細(xì)胞再種植[4]。雖然術(shù)后進(jìn)行化療藥物或卡介苗灌注治療能夠降低膀胱癌術(shù)后復(fù)發(fā)率，但是其術(shù)后五年復(fù)發(fā)率仍高達(dá)44.8%～55.8%，嚴(yán)重威脅著我國(guó)膀胱癌患者的生命健康[5]。因此研究有效降低膀胱癌術(shù)后復(fù)發(fā)的灌注新藥物已經(jīng)成為臨床上迫切需要解決的實(shí)際問題[6,7]。

隨著納米生物材料的研究進(jìn)展，其在腫瘤治療上的應(yīng)用得到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛認(rèn)可[8,9]。目前氧化鐵納米顆粒(Iron oxide nanoparticles,ION)已被美國(guó)藥品食品管理局(Food and drug administration,FDA)批準(zhǔn)作為臨床用藥，用來進(jìn)行核磁成像以及慢性腎病性貧血的治療[10]。然而ION是否對(duì)實(shí)體瘤有治療作用，目前尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。ION經(jīng)靜脈注射后易被單核吞噬系統(tǒng)吞噬而富集于巨噬細(xì)胞，進(jìn)而誘發(fā)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生活性氧(Reactive oxygen species,ROS)，損傷周圍組織。該現(xiàn)象為腫瘤治療提供了新思路。本研究旨在探討ION是否可以通過誘導(dǎo)膀胱腫瘤內(nèi)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生ROS，進(jìn)而抑制膀胱腫瘤的復(fù)發(fā)與生長(zhǎng)，為ION發(fā)展為新型膀胱癌術(shù)后灌注藥物的可能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及動(dòng)物 小鼠非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌細(xì)胞系MB49購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7購(gòu)自ATCC；6周齡C57BL/6J雌性小鼠購(gòu)自北京維通利華有限公司。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑 羧甲基葡聚糖包裹ION(西安瑞禧生物有限公司，中國(guó))；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司，美國(guó));CCK-8試劑盒、ROS試劑盒(碧云天公司，中國(guó))；Calcein-AM/PI活細(xì)胞/死細(xì)胞雙染試劑盒(翊圣生物，中國(guó))。

1.1.3主要儀器 熒光倒置顯微鏡(Olympus公司，日本)；酶標(biāo)儀(MK3型)、細(xì)胞培養(yǎng)箱、細(xì)胞超凈臺(tái)、離心機(jī)(Thermo公司，美國(guó))。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將MB49細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿，用完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，放置于37℃、CO2含量為5%的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)，視細(xì)胞生長(zhǎng)情況每2～3 d進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.2.2ROS檢測(cè)及分組 將ION離心后棄上清溶解于完全培養(yǎng)基并超聲振蕩重懸，制備成濃度為3 mg/ml 的培養(yǎng)基，對(duì)照組為完全培養(yǎng)基。將1×104MB49接種于Transwell小室下室，將RAW264.7接種于Transwell小室上室，具體分組如下：MB49組；RAW264.7組；ION組；RAW264.7+MB49組；MB49+ION組；RAW264.7+ION組；RAW264.7+MB49+ION組。將7組細(xì)胞分別設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)12 h后取培養(yǎng)基上清，離心后進(jìn)行ROS試劑盒檢測(cè)。將RAW264.7培養(yǎng)于ION培養(yǎng)基中，實(shí)驗(yàn)組放入去鐵胺(Desferrioxamine，DFO，400 μmol/ml)，培養(yǎng)12 h后取培養(yǎng)基上清，離心后進(jìn)行ROS檢測(cè)。

1.2.3CCK-8檢測(cè)RAW264.7吞噬ION后對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用 將MB49接種于Transwell小室下室，將RAW264.7接種于Transwell小室上室，分別培養(yǎng)于ION培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基。具體分組如下：MB49組；MB49+RAW264.7組；MB49+RAW264.7+ION組；MB49+RAW264.7+ION+DFO組。培養(yǎng)12 h后，CCK-8檢測(cè)各組下室MB49增殖活性。并對(duì)各組進(jìn)行Calcein-AM/PI染色，顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.2.4膀胱腫瘤種植模型 將40只C57BL/6J雌性小鼠隨機(jī)分成2組，每組20只。腹腔注射0.1%戊巴比妥麻醉后，用24G留置針經(jīng)尿道插入小鼠膀胱，建立通道。實(shí)驗(yàn)組向膀胱內(nèi)注射細(xì)胞數(shù)1×106、ION濃度為3 mg/ml的MB49細(xì)胞懸液0.1 ml;對(duì)照組僅注射相同細(xì)胞數(shù)的MB49 PBS懸液0.1 ml。夾閉留置針1 h后拔出，讓小鼠自行排尿。一周后將小鼠處死，檢測(cè)其膀胱癌成瘤率。

1.2.5膀胱癌皮下瘤模型的建立及瘤內(nèi)注射治療 將12只C57BL/6J雌性小鼠隨機(jī)分成2組，每組6只。腹腔注射0.1%戊巴比妥麻醉后，在小鼠右肩部注射細(xì)胞數(shù)為1×106的0.1 ml MB49細(xì)胞懸液，建立小鼠皮下瘤膀胱癌模型。并每日用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤大小，待腫瘤大小為100 mm3時(shí)，實(shí)驗(yàn)組瘤內(nèi)注射0.1 ml濃度為3 mg/ml 的ION懸液，對(duì)照組注射0.1 ml PBS，每5 d測(cè)量小鼠皮下瘤大小，并記錄。

2 結(jié)果

2.1ION誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生ROS 巨噬細(xì)胞具有吞噬納米顆粒的特性，而腫瘤細(xì)胞在正常條件下吞噬能力較弱。圖1A為所購(gòu)ION的透射電鏡圖片，ION平均直徑大小為30 nm。在相同濃度ION干預(yù)下，MB49直徑在ION培養(yǎng)下，ROS產(chǎn)量較少，而RAW264.7與ION可產(chǎn)生較多ROS,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而MB49+RAW264.7+ION組中ROS在所有實(shí)驗(yàn)組中含量最高(P<0.01)，這可能是由于MB49在ROS作用下細(xì)胞發(fā)生損傷，釋放相關(guān)抗原，進(jìn)一步刺激巨噬細(xì)胞活化導(dǎo)致[10]。(圖1B)。

2.2RAW264.7吞噬ION產(chǎn)生中的ROS可以被DFO抑制 為進(jìn)一步研究INO釋放的鐵離子在ROS產(chǎn)生中的必要作用，我們用DFO清除培養(yǎng)基中的鐵離子。實(shí)驗(yàn)組在RAW264.7與ION培養(yǎng)基中加入DFO后，如圖2A細(xì)胞培養(yǎng)基中的ROS明顯下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3ION培養(yǎng)下RAW264.7能夠抑制MB49增殖并促進(jìn)凋亡 如圖2B，CCK-8實(shí)驗(yàn)表明，MB49在與RAW264.7和ION共培養(yǎng)下，增殖能力明顯受到抑制，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而MB49單獨(dú)與RAW264.7共培養(yǎng)組，增殖抑制差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Calcein-AM/PI染色檢測(cè)MB49共培養(yǎng)細(xì)胞死亡情況，如圖2C所示，MB49+RAW264.7+ION組相比MB49組與MB49+RAW264.7組細(xì)胞死亡數(shù)量明顯增加。而加入DFO后，隨著ROS的下降，MB49細(xì)胞死亡減少，說明鐵離子是ROS抑制MB49細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的必要因素。

圖1 RAW264.7吞噬ION后產(chǎn)生ROSFig.1 ION induces macrophage to produce ROSNote: A.Transmission electron microscope(TEM)of ION;B.Macrophage release ROS in different culturing situations.Compared with control group(MB49 alone)，#.P>0.05,*.P<0.05,**.P<0.01.

圖2 ROS抑制腫瘤活性Fig.2 ROS inhibits tumor cellsNote: A.DFO reduces ROS by eliminating iron;B.Cell viability of MB49 in different culturing situations;C.Calcein-AM/PI staining in different culturing situations.Compared with control group(MB49 alone)，#.P>0.05,*.P<0.05.

2.4ION能夠抑制MB49膀胱腫瘤種植 如圖3A，留置針經(jīng)尿道插入C57BL/6J雌性小鼠，成功建立膀胱腫瘤種植模型。實(shí)驗(yàn)組(MB49+ION)成瘤率為10%(2/20)，對(duì)照組(MB49+PBS)成瘤率為90%(18/20)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。ION能夠明顯抑制MB49對(duì)膀胱腫瘤的種植(圖3B)。

2.5瘤內(nèi)注射能夠抑制MB49皮下瘤生長(zhǎng) 在種瘤后第5天，小鼠皮下瘤大小約100 mm3，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別進(jìn)行瘤內(nèi)注射干預(yù)后，每5 d觀測(cè)腫瘤大小。如圖3C所示，實(shí)驗(yàn)組腫瘤生長(zhǎng)明顯受到抑制，結(jié)果表明瘤內(nèi)注射能夠抑制MB49皮下瘤生長(zhǎng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ION抑制膀胱癌Fig.3 ION inhibits bladder cancer in vivoNote: A.Establishment of cell implanting model;B.ION prevents bladder cancer cell implanting into bladder wall;C.ION inhibits tumor growth by intratumor injection.Compared with PBS group，*.P<0.05.

3 討論

膀胱癌是我國(guó)泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其中非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌約占膀胱癌總數(shù)的75%。對(duì)于非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌治療的金標(biāo)準(zhǔn)為經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)。但是膀胱癌術(shù)后極易復(fù)發(fā)，雖然臨床上患者術(shù)后常規(guī)膀胱灌注化療藥物或卡介苗來抑制腫瘤復(fù)發(fā)，但治療效果仍然不理想，術(shù)后5年復(fù)發(fā)率仍可高達(dá)44.8%～55.8%[5]。納米材料的興起為開發(fā)新型膀胱灌注藥物制劑提供了新的可能?，F(xiàn)階段國(guó)內(nèi)外學(xué)者在預(yù)臨床研究中，通過優(yōu)化灌注藥物劑型在抑制膀胱癌的研究中取得了一定的成果。然而由于上述材料制備過于復(fù)雜，很難投入臨床使用[9]。因此尋找能夠快速進(jìn)行臨床轉(zhuǎn)化的新型術(shù)后膀胱灌注藥物具有重要的臨床意義。ION已被FDA批準(zhǔn)用于臨床成像及治療慢性腎病性貧血等疾病，但目前尚無ION直接抑制腫瘤的臨床報(bào)道。Zanganeh等[10]于2016年報(bào)道了將乳腺癌細(xì)胞與ION共同注射到小鼠乳腺中可以使小鼠乳腺癌延遲生長(zhǎng)，并且可以抑制腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。這一研究首次提出了ION可能具有潛在的抗瘤作用，但是并沒有證明ION對(duì)已生長(zhǎng)出的腫瘤具有抑制作用。因此研究并證實(shí)ION對(duì)于阻止膀胱癌細(xì)胞再種植以及抑制小癌灶具有重要意義，能夠?yàn)镮ON作為新型膀胱灌注藥物提供預(yù)臨床的理論依據(jù)。

本研究通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ION在細(xì)胞水平通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生ROS抑制腫瘤活性，促進(jìn)腫瘤的死亡。同時(shí)在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了其抑制腫瘤的確切效果。巨噬細(xì)胞作為固有免疫防線的重要細(xì)胞之一，具有強(qiáng)大的吞噬功能。大量文獻(xiàn)指出，納米顆粒可以被巨噬細(xì)胞吞噬，而ION被吞噬后可以釋放Fe2+，巨噬細(xì)胞中的H2O2可以與Fe2+通過芬頓反應(yīng)生成OH·釋放到細(xì)胞外，作為強(qiáng)氧自由基殺傷腫瘤細(xì)胞。而用DFO將游離的Fe2+通過絡(luò)合反應(yīng)去除后，巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的氧自由基明顯下降，這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合。

本研究進(jìn)一步通過兩種動(dòng)物模型模擬膀胱癌復(fù)發(fā)的兩種主要因素，即游離腫瘤細(xì)胞再種植和術(shù)后殘余灶。兩種動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ION能夠降低膀胱癌細(xì)胞種植于膀胱內(nèi)壁，降低原位癌模型成瘤率；同時(shí)能夠抑制腫瘤的生長(zhǎng)，具有良好的抗瘤作用。

綜上所述，ION可以通過巨噬細(xì)胞產(chǎn)生殺傷膀胱癌細(xì)胞的ROS自由基，能夠抑制腫瘤細(xì)胞在膀胱壁的種植以及小腫瘤的生長(zhǎng)，本研究為ION作為新型膀胱灌注制劑提供了預(yù)臨床理論依據(jù)，其是否可以作為新型膀胱灌注藥物有待臨床研究進(jìn)一步證實(shí)。