李慧娟 張 黎 姜 姍 劉 淼 干銀弟 李 青

(湖北省第三人民醫(yī)院，武漢430010)

胰腺癌(Pancreatic carcinoma)是胰腺外分泌癌，是世界上最致命的癌癥之一[1]，目前其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)均有增多的趨勢，且胰腺癌早期癥狀不明顯，發(fā)病隱匿，診斷困難。在胰腺癌的治療上，除手術(shù)以外，目前沒有更有效的方式可以改善。以傳統(tǒng)的放療和化療手段治療胰腺癌效果不明顯，而且使用化療藥物對胰腺癌進行治療存在化療抵抗性、遠期高復發(fā)率等難題。如果不能在早期手術(shù)切除病灶，胰腺癌的中位生存時間只有8個月左右[2]。研究顯示，胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展與癌基因異常激活、抑癌基因失活以及DNA修復機制異常等存在密切聯(lián)系[3,4]。PRR11信號通路和癌癥的發(fā)展存在密切關(guān)系，Proline-rich protein 11(PRR11)在胃癌、直腸癌、肺癌等組織或者相關(guān)癌細胞中均表達上升[5-7]，但其與胰腺癌的關(guān)系尚不明確。本研究以胰腺癌組織和胰腺癌細胞為研究對象，探討PRR11與胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展之間的聯(lián)系。

1 資料與方法

1.1臨床資料 67例胰腺癌組織和胰腺癌旁組織樣本均來自本院住院部自2015年11月至2016年4月的胰腺癌患者，平均年齡(57.11±3.32)歲，其中男34例，女33例。經(jīng)組織病理學證實為原發(fā)性胰腺導管腺癌，術(shù)前均未進行化療、放療或生物治療，具有完整的病例資料。胰腺癌旁組織作為對照。羊抗人PRR11單克隆抗體 和兔抗羊二抗購于Abcam公司。

1.2方法

1.2.1PCR檢測PRR11的表達 用TaKaRa 公司TRI Reagent?提取組織總RNA。使用TaKaRa 公司 Premix Ex TaqTMHot Start Version 擴增PRR11片段，采用優(yōu)晶公司生產(chǎn)的凝膠回收試劑盒Ⅱ進行PCR產(chǎn)物的純化，以純化后的PCR產(chǎn)物作為模板，使用美國 ABI 公司的 BigDyeTerminator v3.1試劑盒進行PCR測序反應。

1.2.2免疫組化檢測PRR11的表達 組織標本用10%的中性甲醛固定，石蠟包埋后切片，烘干，二甲苯脫蠟，梯度乙醇復水，高溫高壓檸檬酸抗原修復3 min，雙氧水孵育10 min，PBS沖洗3次，血清封閉15 min，滴加一抗4℃孵育過夜，PBS沖洗3次，滴加二抗孵育，PBS 沖洗3次，DAB 顯色劑顯色，充分沖洗，鹽酸酒精分化，封片后觀察。結(jié)合染色程度和陽性細胞數(shù)目進行評分，其中染色程度0分=不著色陰性，1分=淺黃色，2分=棕黃色，3分=黃褐色；陽性細胞數(shù)0分：陽性細胞<10%，1分：10%<陽性細胞<50%，2分：50%<陽性細胞<75%，3分：陽性細胞>75%。染色程度和陽性細胞數(shù)目兩項得分相乘作為最后的評分，將評分≤3分視為陰性，>3分視為陽性，評分越高表明含量越高。

1.2.3胰腺癌細胞的篩選 CFPAC-1、PATU8988、SW1990、PANC-1共4種胰腺癌細胞均來自創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司。選擇對數(shù)期細胞，以RT-PCR的方法檢測PRR11在4種細胞中的表達，比較其表達水平。

1.2.4PRR11對SW1990的影響 將SW1990細胞分為對照組、敲減PRR11空載組(siRNA-NC組)、敲減PRR11組(siRNA-PRR11組)。

根據(jù)siRNA靶序列篩選設計原則，結(jié)合分析PRR11的基因序列，以Ambion公司siRNA靶序列分析設計系統(tǒng)，選擇確定1條特異性siRNA靶序列，然后設計合成寡核苷酸的正義鏈和反義鏈。將合成的寡核苷酸片段的正義鏈和反義鏈進行退火處理。即先將其分別溶于雙蒸水中，等摩爾數(shù)混合后90℃加熱 3 min，自然降溫至37℃后，形成雙鏈的寡核苷酸。將合成的發(fā)卡siRNA插入經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切的siRNA表達載體pSilencer 2．1-U6neo中，成功構(gòu)建抑制PRR11表達的siRNA重組質(zhì)粒。

1.2.5RT-PCR檢測凋亡相關(guān)基因 選擇對數(shù)期細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板，復氧2 h后收集細胞，用Trizol法提取各組總RNA，用Real-Time PCR試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。PCR引物經(jīng)Primer6.0軟件設計。B淋巴細胞瘤-2基因(BCL2)：上游 5′-TGAACTGGGGGAGGATTGTG-3′，下游 5′-TTCACTTGTGGCCCAGATAGG-3′；Caspase 3：上游 5′-GGCGCTCTGGTTTTCGTTAATA-3′，下游 5′-GCTGCATCGACATCTGTACC-3′；PRR11：上游：5′-CCATCTCGTATCTGCCACCG-3′，下游 5′-AGTGCT-TTAGCGAGACTGGG-3′。采用2-ΔΔCt法進行數(shù)據(jù)結(jié)果分析。

1.2.6CCK-8檢測增殖 取處于對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的SW1990細胞，用培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度到5×103個/100 μl，種入96孔板，每孔100 μl細胞懸液，同時設空白組，37℃培養(yǎng)過夜(在細胞孔周圍孔內(nèi)加入100 μl無菌PBS)；每組5個復孔，37℃培養(yǎng)24 h；每孔加入100 μl含10%CCK-8的PBS溶液，37℃培養(yǎng)4 h；酶標儀測定各孔在450 nm波長下的吸光值OD。

1.2.7Transwell檢測細胞遷移 胰蛋白酶消化并收集對數(shù)期細胞，用PBS洗2遍，無血清的DF-12培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞密度至5×105ml-1。均勻加入400 μl 細胞懸液至上室，實驗組藥物濃度為8、16和32 μg/ml，對照組不加藥；下室加入含10%FBS的DF-12培養(yǎng)基600 μl，每組設置3個復孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出上室，用棉簽擦去上室細胞，多聚甲醛固定15 min，棄固定液，0.1%結(jié)晶紫染液染色10 min，PBS洗3遍，顯微鏡下攝片并計數(shù)。

2 結(jié)果

2.1PRR11在胰腺癌組織中的表達 如圖1所示，根據(jù)PRR11免疫組化的結(jié)果，可見癌旁組織的染色程度得分為0分，經(jīng)過計數(shù)可得陽性細胞得分為0分，為PRR11陰性。胰腺癌組織免疫組化結(jié)果中呈現(xiàn)黃棕色，染色程度得分為3分，經(jīng)過計數(shù)可得陽性細胞得分為2分，總得分為6分，為PRR11陽性。PRR11在癌旁組織的表達顯著低于胰腺癌組織(P<0.05)。

2.2胰腺癌細胞的篩選 檢測PRR11在CFPAC-1、PATU8988、SW1990、PANC-1共4種胰腺癌細胞中的表達，結(jié)果顯示PRR11在SW1990的表達最高，顯著高于CFPAC-1、PATU8988、PANC-1(P<0.05)。因此，SW1990比較適合作為PRR11的研究對象。見圖2。

2.3PRR11對SW1990的影響

2.3.1PRR11在SW1990中的表達 檢測PRR11在SW1990中的表達， 結(jié)果顯示PRR11在si-PRR11組的表達顯著低于對照組和si-NC組(P<0.05)。對照組和si-NC組沒有顯著性差異(P>0.05)。見圖3。

圖1 PRR11在胰腺癌組織和癌旁組織中的表達

Fig.1 Expression of PRR11 in pancreatic cancer and adjacent tissues

Note: A.The expression of PRR11 in paracancerons tissues;B.The expression of PRR11 in pancreatic cancer.

圖2 胰腺癌細胞的篩選Fig.2 Screening of pancreatic cancer cellsNote: *.P<0.05.

圖3 PRR11在SW1990中的表達Fig.3 Expression of PRR11 in SW1990 cellsNote: *.P<0.05.

2.3.2PRR11對SW1990細胞增殖的影響 SW1990細胞的生存曲線見圖4。與si-NC組比較，si-PRR11組細胞的增殖在24 h和72 h均顯著增加(P<0.05)。對照組和si-NC組沒有顯著性差異(P>0.05)。

2.3.3凋亡相關(guān)基因的表達 檢測Caspase 3、BCL2在SW1990細胞不同處理組的表達，見圖5。與對照組比較，Caspase 3在si-PRR11組的表達顯著升高，BCL2顯著降低(P<0.05)。對照組和si-NC組沒有顯著性差異(P>0.05)。

圖4 SW1990細胞的增殖曲線Fig.4 Proliferation curve of SW1990 cells

圖5 凋亡相關(guān)基因的表達Fig.5 Expression of apoptosis related genesNote: *.P<0.05.

圖6 PRR11對SW1990的遷移的影響Fig.6 Impact of PRR11 on migration of SW1990Note: A.The control group;B.The si-NC group;C.The si-PRR11 group；D.The statistical chart of cell migration.*.P<0.05.

2.3.4Transwell檢測遷移 與對照組比較，si-PRR11組SW1990細胞的遷移能力顯著降低(P<0.05)。對照組和si-NC組沒有顯著性差異(P>0.05)。見圖6。

3 討論

胰腺癌的惡性程度高，早期易發(fā)生侵襲和遷移，預后較差。根據(jù)全球的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，5年內(nèi)的生存率僅有4%，胰腺癌已經(jīng)成為危害人類健康的重要疾病之一[8,9]。在我國，胰腺癌的病發(fā)率也逐漸增加，而且臨床確診后，大多數(shù)患者已經(jīng)錯失根治性手術(shù)的機會。而能行根治性手術(shù)的患者又有較高的復發(fā)率或者發(fā)生轉(zhuǎn)移的可能[10]。胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展是個極其復雜的生物過程，其中受到多種因素和多個基因的調(diào)控。有學者指出，惡性腫瘤難以治愈的根本原因在于腫瘤細胞的無限增殖，其無限增殖則是基于細胞周期的調(diào)控發(fā)生紊亂，PRR11是調(diào)控細胞分裂和細胞周期的相關(guān)基因，位于染色體17q23的擴增區(qū)，而17q23的拷貝區(qū)在肺癌、腦瘤、肺癌、乳腺癌、卵巢癌等多種腫瘤上顯著增加且其擴增與多種腫瘤的發(fā)展、惡化和預后有關(guān)[5-7,11-14]。目前，在該區(qū)域已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量與腫瘤相關(guān)的因子，如BRIP1、TRIM 37、和RPS6KB 1等[15-17]。Yi等[13]認為，17q23的拷貝區(qū)在肺癌上顯著增加，實驗表明在肺癌中，PRR11的表達顯著增加。

本實驗研究了PRR11在胰腺癌組織中的表達情況，并在幾種胰腺癌細胞中檢測PRR11的表達，選擇PRR11表達最顯著的SW1990細胞進行研究和檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在67例胰腺癌患者中，PRR11在胰腺癌組織的表達明顯高于癌旁組織，免疫組化的結(jié)果顯示，PRR11在細胞質(zhì)中呈棕色陽性表達，這與Tan等[18]的臨床研究結(jié)果相符合。通過對PRR11敲減處理，在SW1990胰腺癌細胞上進行驗證，結(jié)果顯示PRR11敲減后，PRR11在SW1990細胞的表達顯著降低。此外，si-PRR11組的促凋亡基因Caspase 3的表達顯著上調(diào)，BCL2顯著降低，表明敲減PRR11基因可能促進SW1990胰腺癌細胞的凋亡。與對照組比較，si-PRR11組SW1990細胞的遷移能力顯著降低，提示敲減PRR11后可降低SW1990細胞的遷移。

綜上所述，PRR11是影響胰腺癌發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵基因之一，PRR11的研究將為胰腺癌的致病機制和治療提供一定的理論基礎。但是胰腺癌的發(fā)生是個非常復雜的生物過程，其診斷和治療還有待進一步探究。