黃 潔 吳娟娟 陳 實 石 奕 李承紅

(江漢大學(xué)附屬醫(yī)院武漢市第六醫(yī)院呼吸內(nèi)科，武漢430025)

目前中國肺癌病死率占所有癌癥的第一位，且隨著環(huán)境污染的加重，吸煙和高溫爆炒的烹飪習(xí)慣等，肺癌發(fā)病率和死亡率還在不斷攀升，預(yù)計到2025年中國將成為世界第一肺癌大國[1]。肺癌的治療方式包括切除、放療和化療等，其中藥物化療在中晚期肺癌治療中占據(jù)著舉足輕重的地位[2]。由于肺癌對傳統(tǒng)藥物敏感性低且易耐受[3]，尋找一種更有效的肺癌化療藥物是目前的研究重點(diǎn)。

中國是茶的故鄉(xiāng)。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，有飲茶習(xí)慣的人群癌癥發(fā)生率低于非飲茶人群，這種現(xiàn)象提示茶對惡性腫瘤有一定的預(yù)防作用[4]。綠茶由于其特殊的加工工藝，更多地保留了新鮮茶葉中的有效成分，因此起到明顯的抗癌效果。綠茶中的主要成分茶多酚占茶葉干重的18%～36%，茶多酚大部分為兒茶素，兒茶素有EGCG、EGC、ECG等，其中EGCG含量最多，約占兒茶素的80%[5]。EGCG對正常細(xì)胞無毒副作用，而對胃癌、肝癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌等腫瘤細(xì)胞都具有抑制作用[6-8]。這些都提示EGCG是一種具有廣闊開發(fā)和應(yīng)用前景的抗癌物質(zhì)。

本研究擬通過肺癌NCI-H1975細(xì)胞建立裸鼠移植瘤模型，用EGCG干預(yù)，探討EGCG對裸鼠肺癌NCI-H1975移植瘤生長的抑制作用以及VEGF mRNA、EGFR、p-Akt、NF-κB(p65)、Ki67和PCNA表達(dá)的調(diào)控，為EGCG抗肺癌的臨床應(yīng)用研究積累新的數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要試劑和儀器 肺癌細(xì)胞株NCI-H1975購自美國ATCC組織細(xì)胞庫；EGCG和十二烷基硫酸鈉(SDS)購自Sigma公司；蘇木素、伊紅、RIPA(強(qiáng))組織細(xì)胞快速裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強(qiáng)型)，VEGF、Ki67和PCNA抗體均購自bioswamp公司；Protein G Magnetic Beads購自Cell Signaling公司；蛋白質(zhì)Marker購自Thermo公司；PVDF轉(zhuǎn)移膜和化學(xué)發(fā)光試劑購自millipore 公司；正置顯微鏡購自徠卡顯微系統(tǒng)有限公司；全自動化學(xué)發(fā)光分析儀購自上海天能科技有限公司；酶標(biāo)儀購自芬蘭雷勃。

1.2方法

1.2.1動物模型建立、分組及給藥 飼養(yǎng)28只雄性裸鼠，在6周齡時通過皮下注射，在小鼠腋窩皮下給予肺癌NCI-H1975細(xì)胞(1×106個細(xì)胞)。SPF環(huán)境內(nèi)飼養(yǎng)，并每日觀察接種部位。于2周后裸鼠腋窩移植瘤明顯突出，待移植瘤生長至長徑約8 mm時，將裸鼠隨機(jī)分為生理鹽水模型組，EGCG低、中和高劑量組[10、50、100 mg/(kg·d)]，每組7只。實驗組每日EGCG灌胃，模型組每日同等體積生理鹽水灌胃，共灌胃3周。

1.2.2檢測EGCG對裸鼠肺癌NCI-H1975移植瘤的抑瘤率 停藥24 h后，通過脫臼法斷頸處死所有裸鼠，并摘取腫瘤組織、稱重，以游標(biāo)卡尺測量移植瘤的長徑(L)和短徑(W)，移植瘤體積(V)=π×L×W2/6，根據(jù)移植瘤的平均體積繪制腫瘤生長曲線。抑瘤率(%)=(模型組平均瘤重-實驗組平均瘤重)/模型組平均瘤重×100%[9]。

1.2.3HE染色觀察移植瘤組織學(xué)形態(tài)變化 將摘自裸鼠的腫瘤組織在中性甲醛中固定24 h，脫水透明，浸蠟包埋，切片貼片，脫蠟染色，于200倍光學(xué)顯微鏡下拍照觀察裸鼠移植瘤的組織學(xué)形態(tài)變化。

1.2.4免疫組化法檢測移植瘤VEGF、Ki67和PCNA的表達(dá) 將石蠟切片脫蠟，暴露抗原，加入40 μl 一抗，4℃孵育過夜，滴加40 μl二抗，室溫孵育。蘇木素溶液復(fù)染，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡拍照觀察。光鏡下黃色或棕黃色顆粒為陽性結(jié)果，且黃色或棕黃色顆粒越多，即蛋白的表達(dá)水平越高。

1.2.5RT-qPCR檢測移植瘤VEGF mRNA表達(dá) 嚴(yán)格按試劑說明書配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，合成cDNA。取2 μl cDNA為模板，配制25 μl Real-time PCR反應(yīng)體系:2×SuperReal Premix 12.5 μl；上、下游引物(10 μmol/L)各0.75 μl；RNase-free ddH2O 9 μl，按如下條件進(jìn)行PCR反應(yīng):95℃預(yù)變性15 min，95℃變性10 s，60℃退火延伸30 s，擴(kuò)增40個循環(huán)，擴(kuò)增結(jié)束后制作融解曲線。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算VEGF mRNA的相對表達(dá)量。

1.2.6Western blot檢測移植瘤EGFR、p-Akt、NF-κB(p65)、Ki67和PCNA表達(dá) 于-80℃冰箱中稱取腫瘤組織0.2 g，以預(yù)冷的PBS洗滌3次，并用眼科剪將組織剪碎于EP管中，將組織轉(zhuǎn)入勻漿器，再加入組織裂解液，于4℃裂解30 min，離心，棄上清，BCA蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行蛋白定量。電泳前將蛋白樣品按5∶1比例加入6×loading buffer，煮沸5 min 后即用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳。4℃條件下23 V電壓濕轉(zhuǎn)12 h。預(yù)制5% TBS-脫脂奶粉封閉液，室溫封閉1 h后加入稀釋的EGFR(1∶1 000)、p-Akt(1∶1 000)，NF-κB(p65)(1∶1 000)，Ki67(1∶5 000)和PCNA(1∶2 000)一抗，4℃孵育過夜，TBST漂洗5 min×6次后加入適當(dāng)濃度(1∶5 000)的二抗，室溫孵育1 h。TBST漂洗5 min×4次。暗室內(nèi)浸入ECL液進(jìn)行顯影，以GAPDH為內(nèi)參，全自動化學(xué)發(fā)光分析儀檢測。

2 結(jié)果

2.1裸鼠移植瘤的體積變化 實驗期間各組裸鼠的飲食、體征均正常，無裸鼠死亡情況。根據(jù)各組裸鼠在干預(yù)后1、5、9、13、17和21 d的瘤體平均體積繪制移植瘤的生長曲線。雖然各組裸鼠的移植瘤體積在實驗期間不斷增大，但EGCG高劑量組的瘤體生長速度明顯較其余3組緩慢，相對抑瘤效果更好；EGCG低、中劑量組的瘤體生長速度幾乎一致，只比模型組的生長速度稍慢(圖1，2)。

2.2EGCG對裸鼠移植瘤生長的抑制效果 EGCG干預(yù)21 d后，模型組裸鼠體重與EGCG低劑量組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與EGCG中、高劑量組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。模型組瘤體積和瘤重與EGCG低、中、高劑量組相比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。EGCG各組抑瘤率比較:高劑量組>中劑量組>低劑量組(表1)。

2.3HE染色觀察移植瘤組織學(xué)形態(tài)變化 本實驗采用HE染色法觀察EGCG對裸鼠移植瘤組織結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果顯示，模型組腫瘤細(xì)胞未見壞死，血管明顯，細(xì)胞排列緊密，密度較大，腫瘤細(xì)胞異型性明顯，核漿比較大。隨著EGCG作用劑量的增加，纖維增生明顯，腫瘤細(xì)胞大面積壞死，細(xì)胞密度降低，排列疏松，核漿比減小，細(xì)胞核染色質(zhì)深染(圖3)。

2.4免疫組化法檢測移植瘤VEGF、Ki67和PCNA表達(dá) 本研究采用免疫組化法檢測各組裸鼠移植瘤組織VEGF、Ki67和PCNA蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，不同劑量的EGCG組移植瘤VEGF、Ki67和PCNA蛋白表達(dá)均降低(圖4)。

圖1 各組裸鼠移植瘤的生長曲線Fig.1 Growth curve of nude mice tumor in each group

圖2 離體的瘤組織Fig.2 Tumor tissues in vitro

GroupsWeight ofnude mice(g)Volume oftransplanted tumors(mm3)Wegiht oftransplanted tumors(g)Inhibitionrate(%)Model group19.20±1.00655.12±159.221.19±0.17-Low dose EGCG group21.55±0.481) 476.96±171.481)0.95±0.131)20.17 Medium dose EGCG group20.56±0.50324.92±43.171)0.90±0.041)24.37 High dose EGCG group19.80±0.64327.39±85.951)0.89±0.061)25.21

Note：1)P<0.05 vs model group.

GroupsEGFRp-AktNF-κB(p65)Ki67PCNAModel group1.01±0.050.69±0.080.70±0.020.74±0.000.59±0.01Low dose EGCG group0.66±0.011)0.62±0.020.56±0.030.55±0.000.46±0.00Medium dose EGCG group0.57±0.011)0.54±0.02 0.39±0.031)0.41±0.001)0.34±0.001)High dose EGCG group0.46±0.021) 0.37±0.021)2) 0.27±0.001)2)0.29±0.011)2)0.23±0.011)2)

Note：1)P<0.05 vs model group;2)P<0.05 vs low dose EGCG group.

圖3 HE染色觀察各組移植瘤形態(tài)(×200)Fig.3 HE staining to observe morphology of transplanted tumor in each group(×200)

圖4 各組移植瘤VEGF，Ki67和PCNA蛋白的表達(dá)(×200)Fig.4 Expressions of VEGF,Ki67 and PCNA protein in each group(×200)

2.5RT-qPCR檢測移植瘤VEGF mRNA表達(dá) EGCG中和高劑量組的VEGF mRNA相對表達(dá)量顯著低于模型組(P<0.05)；EGCG低劑量組的VEGF mRNA相對表達(dá)量與中、高劑量組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.6Western blot檢測移植瘤EGFR、p-Akt、NF-κB(p65)、Ki67和PCNA表達(dá) Western blot檢測結(jié)果表明:EGCG低、中和高劑量組的EGFR表達(dá)水平顯著低于模型組(P<0.05)；EGCG高劑量組的p-Akt表達(dá)水平顯著低于模型組(P<0.05)；EGCG中和高劑量組的NF-κB(p65)、Ki67和PCNA蛋白表達(dá)水平顯著低于模型組(P<0.05)。EGCG高劑量組的p-Akt、NF-κB(p65)、Ki67和PCNA蛋白表達(dá)水平顯著低于EGCG低劑量組(P<0.05)，見表3。

GroupsVEGFModel group1.01±0.18low dose EGCG group0.95±0.27medium dose EGCG group0.42±0.081)2)high dose EGCG group0.24±0.051)2)

Note：1)P<0.05 vs model group;2)P<0.05 vs low dose EGCG group.

3 討論

肺癌在中國的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，其治療主要采取以手術(shù)、放療和化療為主的綜合模式[10]。研究發(fā)現(xiàn)綠茶提取物EGCG具有多種生物學(xué)活性和藥理效應(yīng)，如抗腫瘤、抗炎、抗病毒、清除自由基和抗氧化等[11]。本研究初步探討EGCG對裸鼠肺癌NCI-H1975移植瘤生長的抑制作用及其可能的機(jī)制。

本研究通過建立裸鼠肺癌NCI-H1975移植瘤模型，觀察EGCG對肺癌腫瘤生長的影響。結(jié)果顯示，EGCG實驗組的移植瘤平均體積和重量明顯小于模型組，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，這說明EGCG具有抑制肺癌NCI-H1975移植瘤生長的作用，且高劑量EGCG抑瘤效果更佳。同樣也有研究表明，EGCG對肝癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌、胃癌等腫瘤細(xì)胞有一定的抑制作用[7,8,12]。

HE染色觀察EGCG對肺癌NCI-H1975移植瘤形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果顯示EGCG實驗組細(xì)胞數(shù)量顯著減少，且腫瘤細(xì)胞大面積壞死，纖維增生明顯，核漿比減小，細(xì)胞核染色質(zhì)深染等，表明EGCG有一定的促肺癌細(xì)胞凋亡作用。

VEGF是腫瘤血管形成過程中的一種關(guān)鍵性調(diào)控因子[13]，它通過與特異性受體結(jié)合進(jìn)行信號傳導(dǎo)，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，提高血管通透性并與細(xì)胞外基質(zhì)相聯(lián)系，有利于腫瘤血管的生成和浸潤[14]。PCNA是一種直接參與DNA合成的核內(nèi)蛋白[15]，而Ki67是與細(xì)胞周期有關(guān)的核增殖標(biāo)志物[16]，這兩者均是評價細(xì)胞增殖活性的指標(biāo)。本研究免疫組化和Western blot檢測結(jié)果顯示，不同劑量EGCG組的VEGF、Ki67和PCNA表達(dá)水平均明顯降低，提示EGCG可能是通過下調(diào)腫瘤組織VEGF，Ki67和PCNA的表達(dá)，減少腫瘤血管的生成，干擾腫瘤細(xì)胞DNA的合成，阻止細(xì)胞增殖，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長。

EGFR是細(xì)胞信號通路中的一種關(guān)鍵性因子。在正常情況下，EGFR在組織中低表達(dá)，主要參與維持細(xì)胞的增殖、存活、黏附、遷移及分化等[17]。當(dāng)EGFR異常表達(dá)或持續(xù)性活化時，會導(dǎo)致下游信號通路的異?；罨?，如PI3K/Akt通路的激活，使細(xì)胞增殖過度并惡性轉(zhuǎn)化，最終引起腫瘤的發(fā)生。

PI3K/Akt是癌細(xì)胞存活的首要通路，有抗凋亡途徑之稱。Akt是PI3K下游的直接靶蛋白，可被PI3K激活，活化的Akt(p-Akt)可參與各種類型的細(xì)胞生長、生存和分化，同時還可上調(diào)抗凋亡基因的表達(dá)水平，抑制細(xì)胞凋亡或者活化其他通路，使細(xì)胞能適應(yīng)生存，因此，Akt可能與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。p-Akt才有生物學(xué)功能，而且在大多數(shù)腫瘤組織中過度表達(dá)[18]。

NF-κB是一種幾乎存在于所有細(xì)胞中的重要核轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控與炎癥、細(xì)胞增殖及凋亡等相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)蛋白合成[19]。NF-κB(p65)是NF-κB中的一個亞單位，主要參與基因轉(zhuǎn)錄的起始調(diào)節(jié)，NF-κB(p65)的持續(xù)活化可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，減弱細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤新生血管的生成，提高腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移能力[20]。

本研究中Western blot 檢測結(jié)果顯示，與模型組相比，EGCG實驗組尤其是高劑量組下調(diào)了EGFR、p-Akt和NF-κB(p65)的表達(dá)水平，提示EGCG抗肺癌的機(jī)制可能是：①通過下調(diào)EGFR的表達(dá)來抑制下游信號通路的異?；罨瑥亩柚辜?xì)胞過度增殖并惡性轉(zhuǎn)化；②通過下調(diào)p-Akt的表達(dá)來調(diào)控PI3K/Akt信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，減少p-Akt參與的細(xì)胞生長、生存和分化，并減少抗凋亡基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤的生長；③下調(diào)NF-κB(p65)的表達(dá)水平，抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，減少腫瘤新生血管的生成，降低腫瘤細(xì)胞的浸潤轉(zhuǎn)移能力。

綜上所述，EGCG對裸鼠肺癌NCI-H1975移植瘤的生長有一定的抑制作用，且高劑量組的抑瘤效果更佳。EGCG抑制移植瘤生長的機(jī)制可能是下調(diào)腫瘤組織VEGF mRNA、EGFR、p-Akt、NF-κB(p65)、Ki67和PCNA的表達(dá)水平。