薛 松，陳映霞，秦叔逵，蔣宗惠，董祥寧

胃癌是我國常見的惡性腫瘤，對患者的生命健康造成了極大的危害。盡管近幾年死亡率略有下降，但仍高居惡性腫瘤死亡率前三位[1]。早期胃癌無特殊臨床表現(xiàn)，大多數(shù)胃癌患者確診時已是中晚期。針對進展期胃癌患者，主要的治療手段是化療。雷替曲塞是一種胸腺酸合成酶(thymidylate synthase，TS)抑制藥，目前廣泛應(yīng)用于不適合氟尿嘧啶的晚期直腸結(jié)腸癌患者[2]。本研究的前期實驗已證實，雷替曲塞能促進體外培養(yǎng)的人胃癌SGC-7901細胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[3]。但雷替曲塞在體內(nèi)是否可誘發(fā)胃癌細胞凋亡及其機制尚未明確。本研究通過觀察雷替曲塞對高度侵襲型胃癌裸鼠移植瘤生長的影響，探討其對胃癌細胞可能的凋亡機制，為雷替曲塞臨床治療胃癌提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 雷替曲塞購自南京正大天晴公司；鼠抗人Ki67、PCNA單克隆抗體購自北京中杉金橋公司；兔抗人Caspase-3單克隆抗體、Bax單克隆抗體購自美國Cell Signaling公司；ECL Kit、PVDF膜購自南京凱基公司。

1.2 實驗動物和細胞株 BALB/C nu/nu雄性裸鼠24只，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，實驗動物質(zhì)量合格證編號為SCXK(滬)2013-0016。鼠齡4周，體重15 g，SPF條件下飼養(yǎng)。所有操作均按照安徽醫(yī)科大學(xué)動物倫理學(xué)規(guī)定進行。將人胃癌細胞株MGC-803置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，在37 ℃、5% CO2恒溫孵育箱中培養(yǎng)，待其貼壁生長至70%～80% 匯合時，用0.05%胰酶消化傳代培養(yǎng)。

1.3 實驗方法

1.3.1 裸鼠人胃癌模型的建立 先將實驗裸鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，收集胰酶消化的對數(shù)生長期的人胃癌MGC-803細胞，800 r/min離心4 min棄上清液。將其配制成為2×107個/ml濃度的單細胞懸液。在無菌環(huán)境中，按照0.2 ml/只接種于裸鼠腋下，放回籠中繼續(xù)飼養(yǎng)，觀察裸鼠的狀態(tài)。1周后24只裸鼠皮下均出現(xiàn)5 mm左右結(jié)節(jié)，表明人胃癌模型建立成功。將荷瘤裸鼠隨機分為以下3組：對照組(生理鹽水)，低劑量組(雷替曲塞5 mg/kg)，高劑量組(雷替曲塞12 mg/kg)，每組8只。每周給藥2次，持續(xù)2周。

1.3.2 雷替曲塞抑瘤作用觀察 給藥期間密切觀察各組裸鼠的一般生長狀況，如精神、飲食、活動等情況，每3天稱重一次。給藥結(jié)束次日將各組裸鼠處死，解剖，在無菌條件下剝離瘤體。對裸鼠重量和剝出的瘤體稱重測量，并對抑瘤率進行統(tǒng)計。計算抑瘤率=(對照組平均瘤重-實驗組平均瘤重)/對照組平均瘤質(zhì)量×100%。將取下的部分瘤塊組織浸泡于4%多聚甲醛溶液中，固定制備成組織石蠟塊，余下部分置于液氮保存。

1.3.3 免疫組化法檢測 采用免疫組化EnVision染色方法。高倍顯微鏡下，由2名病理科醫(yī)師對切片進行盲式閱片，根據(jù)陽性細胞所占比例進行判定，不考慮染色強度，對每張切片選取5張無重復(fù)視野的圖像。

1.3.4 Western blotting檢測 配制含有PMSF的RIPA蛋白裂解液，將腫瘤組織冰上充分裂解后4 ℃離心(12 000g，4 min)。取等量上清液，采用BCA定量法測量蛋白樣品濃度。灌制10% SDS-PAGE凝膠，每孔加入蛋白樣品進行電泳。將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)至PVDF膜，轉(zhuǎn)移用稀釋的脫脂奶粉封閉。稀釋抗及β-actin后4 ℃孵育過夜。次日用TBST沖洗PVDF膜4次，加入二抗，室溫孵育1 h后再次用TBST沖洗。最后將ECL發(fā)光液滴加至PVDF膜上，應(yīng)用凝膠成像儀曝光并顯色，記錄各目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 一般狀況 給藥期間各組裸鼠未出現(xiàn)死亡情況。給藥2周后，與采用雷替曲塞治療的兩組比較，對照組裸鼠出現(xiàn)腹水，進水、飲食量明顯減少，裸鼠體重增加考慮移植瘤增大及腹水導(dǎo)致。雷替曲塞低劑量組裸鼠一般情況良好，飲食量略有減少，進水正常，但高劑量組裸鼠后期進水、飲食量顯著減少，過度消瘦，考慮系藥物毒性所致。治療期間各組裸鼠的體重變化情況見圖1。

圖1 3組荷瘤裸鼠給藥期間體重變化

2.2 移植瘤瘤重及抑瘤率比較 雷替曲塞低劑量組平均瘤體質(zhì)量為(1.00±0.07) g，高劑量組為(0.77±0.09)g，對照組為(1.38±0.09)g，使用雷替曲塞治療的兩組裸鼠瘤重與對照組相比明顯降低(F=107.839,P<0.05)。低劑量組、高劑量組的抑瘤率分別為27.54%、44.20%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 腫瘤組織Ki67、PCNA表達水平 Ki67和PCNA陽性染色主要定位于細胞核，呈棕黃色或棕褐色顆粒狀染色。雷替曲塞兩組裸鼠腫瘤組織中Ki67表達水平明顯低于對照組(F=28.634,P<0.05)，且低劑量組與高劑量組間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；雷替曲塞兩組裸鼠腫瘤組織中PCNA表達水平明顯低于對照組(F=15.373,P< 0.05)，且低劑量組與高劑量組間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05，圖2、表1)。

圖2 給藥后裸鼠移植瘤Ki67、PCNA蛋白的表達

A.Ki67對照組; B.Ki67低劑量組;C.Ki67高劑量組;D.PCNA對照組;E.PCNA低劑量組;F.PCNA高劑量組

組別數(shù)量Ki67PCNA低劑量組858.95±5.49①51.36±8.17①高劑量組842.16±6.80①②37.27±5.99①②對照組870.77±5.6562.00±6.90

注：與對照組比較，①P<0.05；與低劑量組比較，②P<0.05

2.4 腫瘤組織Caspase-3、Bax表達水平 Caspase-3和Bax蛋白是誘導(dǎo)細胞凋亡的關(guān)鍵效應(yīng)酶。給藥后，雷替曲塞兩組裸鼠腫瘤組織中Caspase-3和Bax蛋白表達量均較對照組明顯升高(P<0.05)，且低劑量組與高劑量組間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05，圖3、4)。

圖3 給藥后裸鼠移植瘤3組的蛋白表達

圖4 給藥后裸鼠移植瘤Caspase-3、Bax蛋白的表達

3 討 論

胃癌是全世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，它的發(fā)生發(fā)展與許多因素有關(guān)。早期胃癌可以選擇內(nèi)鏡治療，對于不適合內(nèi)鏡治療的患者可選擇開腹手術(shù)或腹腔鏡手術(shù)。然而很多患者錯過了最佳治療時機，診斷胃癌時已是晚期，失去了手術(shù)機會。對于這部分胃癌患者，目前通常采取以化療為主的綜合治療，這已經(jīng)有了充分的循證學(xué)證據(jù)[4]。晚期轉(zhuǎn)移性胃癌治療棘手，特別是多線治療時的藥物選擇有限，療效欠佳。因此，積極尋找安全有效的化療藥物迫在眉睫。

雷替曲塞是TS特異性選擇性抑制藥，屬于抗代謝類葉酸類似物，國內(nèi)批準(zhǔn)應(yīng)用于晚期結(jié)直腸癌患者。雷替曲塞進入細胞后通過一系列的反應(yīng)產(chǎn)生多聚谷氨酸類化合物，該化合物能抑制TS活性，最終達到抑制DNA合成的目的[5]。雖然雷替曲塞與氟尿嘧啶作用的靶酶相同，均為TS抑制藥，但它們的作用機制不完全相同，不完全交叉耐藥。此外，雷替曲塞較氟尿嘧啶有著較高的安全性，尤其對于有心臟病史的患者，雷替曲塞不會導(dǎo)致氟尿嘧啶類相關(guān)代謝產(chǎn)物蓄積，可以避免氟尿嘧啶類藥物心臟毒性的發(fā)生[6]。ESMO結(jié)直腸指南推薦雷替曲塞作為因心臟病風(fēng)險而不適合氟尿嘧啶類藥物的最佳替代選擇。國內(nèi)外大樣本的臨床試驗已經(jīng)證實了雷替曲塞是晚期結(jié)直腸癌有效的姑息治療方案，有效率高，毒副反應(yīng)可耐受。

除了結(jié)直腸癌領(lǐng)域，回顧性臨床研究顯示雷替曲塞能使部分晚期胃癌患者從治療中獲益且耐受性良好，具有潛在的意義和價值[7]。深入探討其抗腫瘤機制將有助于為臨床實踐提供理論依據(jù)，目前已有雷替曲塞作用于胃癌細胞的相關(guān)實驗報告。師魯靜等[8]研究表明雷替曲塞可能通過抑制Livin基因的表達抑制胃癌細胞株的生長。徐瀚峰等[9]發(fā)現(xiàn)雷替曲塞聯(lián)合奧曲肽對胃癌細胞抑制具有協(xié)同作用，兩藥聯(lián)合可以明顯降低VEGF-C的表達。洪雷等[10]通過荷瘤裸鼠模型發(fā)現(xiàn)，雷替曲塞有明顯抑制胃癌移植瘤生長的作用，與氟尿嘧啶相比抑瘤效果相似，并指出其機制可能與誘導(dǎo)細胞凋亡及細胞周期阻滯有關(guān)，并通過上調(diào)p53表達來發(fā)揮抑瘤作用。馬世華等[11]研究表明雷替曲塞可將人胃癌細胞株細胞S期的比例上升，從而將細胞進程阻滯在G0/G1期。上述實驗證實了雷替曲塞對人胃癌細胞同樣具有增殖抑制作用，并推測其可能通過細胞凋亡來發(fā)揮抑瘤作用。凋亡的基因調(diào)控非常復(fù)雜，Caspase的級聯(lián)反應(yīng)是凋亡的基本過程，由Bcl-2蛋白家族所構(gòu)成的復(fù)雜蛋白間相互作用既能促進也能抑制凋亡的發(fā)生，這取決于其中各種不同蛋白的激活狀態(tài)。但以上實驗均未能詳細闡述雷替曲塞誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡的分子機制。

在前期實驗中，筆者體外觀察到了雷替曲塞可誘導(dǎo)人胃癌SGC-7901細胞發(fā)生凋亡，且呈劑量和時間依賴性，其誘導(dǎo)凋亡的機制可能與Caspase-3、Bax、細胞色素C表達上調(diào)，Bcl-2表達下降有關(guān)[3]。在以上實驗的基礎(chǔ)上，為了明確雷替曲塞在體內(nèi)是否可誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡，本研究建立了人胃癌MGC-803裸鼠移植瘤模型，并初步探討雷替曲塞對胃癌細胞凋亡的相關(guān)作用機制。結(jié)果顯示，雷替曲塞在裸鼠體內(nèi)對人胃癌移植瘤生長具有明顯的抑制作用，呈劑量依賴關(guān)系，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。但也應(yīng)該看到，治療組裸鼠體重與對照組對比普遍偏低，尤其是高劑量組，這表明隨著雷替曲塞劑量的增大，相關(guān)毒性作用也越大。本實驗顯示，胃癌裸鼠移植瘤對照組中的Ki67、PCNA呈高表達，但在雷替曲塞干預(yù)下，治療組的Ki67和PCNA表達水平顯著下降，凋亡蛋白Caspase-3和Bax表達水平顯著升高，實驗說明雷替曲塞在裸鼠體內(nèi)可通過誘導(dǎo)細胞凋亡來抑制腫瘤的增長。

細胞凋亡不同于細胞衰老，是機體細胞發(fā)生的程序性的細胞死亡過程，受到嚴(yán)格的基因調(diào)控。能夠觸發(fā)細胞凋亡的途徑有多種，研究比較多的是死亡受體途徑和線粒體途徑[12]。線粒體是細胞內(nèi)ATP產(chǎn)生的主要地方，除了為細胞供能外，線粒體還是細胞凋亡的調(diào)控中心。線粒體通過釋放細胞色素C、Apaf-1等凋亡誘導(dǎo)因子，激活Caspase的級聯(lián)反應(yīng)，從而導(dǎo)致細胞凋亡[13]。Caspase家族成員均為特異切割天冬氨酸位點的蛋白水解酶，迄今為止至少已發(fā)現(xiàn)14種，在細胞凋亡過程中起關(guān)鍵作用[14]。Caspase-2、8、9和10是凋亡途徑上游的Caspase，為凋亡啟動型Caspase，負責(zé)激活下游Caspase；Caspase-3處于凋亡級聯(lián)反應(yīng)的下游，負責(zé)水解凋亡效應(yīng)分子，一旦活化凋亡不可逆轉(zhuǎn)[15]?；罨腃aspase通過滅活凋亡抑制因子、水解激活促凋亡因子Bid、直接降解細胞骨架相關(guān)蛋白等途徑引起凋亡[16]。Bcl-2家族是調(diào)節(jié)細胞凋亡的線粒體相關(guān)蛋白，可分為兩大類[17]：抗凋亡蛋白(主要包括Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w等)和促凋亡蛋白(Bax、Bak1、Bok等)。Bax是Bcl-2家族中主要的凋亡促進蛋白，活化的Bax轉(zhuǎn)位到線粒體，導(dǎo)致線粒體膜通透性增大，釋放促凋亡因子，最終引起細胞凋亡[18]。

綜上所述，本研究證實，雷替曲塞可以抑制胃癌裸鼠移植瘤的生長，并激活促凋亡蛋白Caspase-3和Bax，推測雷替曲塞可能通過Caspase依賴的線粒體途徑誘導(dǎo)MGC-803細胞凋亡。本研究可為雷替曲塞在胃癌治療領(lǐng)域提供實驗依據(jù)，但仍需進一步深入的研究。