岳樹香,連玉菲,劉廣舒

核因子E2相關因子2(subcellular localization of nuclear factor E2-related factor 2,NRF2)是一種細胞內重要的核轉錄因子，可通過與KELCH樣ECH關聯(lián)蛋白1(kelch-like ECH-associated protein-1,KEAP1)蛋白質的相互作用調節(jié)下游相關基因的表達，在維持細胞內環(huán)境穩(wěn)態(tài)、抗氧化應激和抗炎等過程中發(fā)揮著重要作用[1，2]。NRF2不僅具有保護正常細胞的作用，同時還能夠阻止腫瘤細胞對應激反應的抵抗，提高腫瘤細胞的存活率[3，4]。文獻[4-6]證實，NRF2在胃癌、肺癌和卵巢癌等多種腫瘤中異常高表達，參與細胞增殖、侵襲和遷移等生物學過程，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和藥物抵抗等關系密切。近年來文獻[7]指出，NRF2在前列腺癌組織中異常高表達，與腫瘤的淋巴結轉移、浸潤深度和分期密切相關。然而，NRF2在前列腺癌細胞增殖、侵襲和轉移中的作用尚不明確。因此，本研究以前列腺癌PC-3細胞為研究對象，通過靶向沉默NRF2表達，觀察NRF2對PC-3細胞增殖、侵襲和轉移的影響，并初步探討其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 人前列腺上皮細胞株RWPE-1和前列腺癌細胞株PC-3購于美國ATCC，胎牛血清購于美國Gibco公司，RPMI1640培養(yǎng)液、胰蛋白酶和二甲基亞楓購于北京索萊寶科技有限公司，青霉素-鏈霉素雙抗購于美國Hyclone公司，放射免疫沉淀法(radio-immunoprecipitation assay ,RIPA)裂解液購于美國Thermo Scientific公司，CCK-8試劑盒購于上海碧云天公司，NRF2、基質金屬蛋白酶9(matrix metalloprotein 9,MMP-9)、N-鈣黏附素(N-cadherin)和β肌動蛋白(β-actin)抗體購于美國Abcam公司，細胞核增殖相關抗原(Ki67)、細胞周期蛋白D1(CyclinD1)抗體以及辣根過氧化物酶(Horse reddish peroxidase,HRP)標記的羊抗兔/鼠二抗購于北京中杉金橋生物試劑公司。脂質體2000和反轉錄試劑盒購于美國Invitrogen公司?？俁NA提取試劑盒購于日本TaKaRa公司，倒置顯微鏡購于日本Olympus公司，酶標儀和PCR 擴增儀購于美國Bio-Rad公司。CO2細胞培養(yǎng)箱購于美國Thermo公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 在溫度為37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的條件下，采用含10%胎牛血清和青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI 1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)RWPE-1和PC-3細胞。待細胞貼壁融合達80%左右時，以0.25%胰蛋白酶消化傳代。收集第3～5代細胞進行實驗。

1.3 RT-PCR實驗 參照總RNA提取試劑盒說明書步驟提取待測的RWPE-1和PC-3細胞的總RNA，并將經紫外分光光度計定量合格的RNA反轉錄合成單鏈cDNA。取2 μl cDNA作為模板，與各1 μl的上下游引物、10 μl Master Mix 和6 μl ddH2O充分混合配成20 μl的PCR擴增體系。以β-actin為內參，按照如下反應條件進行PCR擴增：95 ℃預變性 5 min(1個循環(huán))；95 ℃變性 15 s(35個循環(huán))；56 ℃退火30 s(35個循環(huán))；72 ℃延伸30 s(35個循環(huán))。其中，由上海生工合成的引物序列分別為：NRF2正向引物，5′-TCAGCGACGGAAAGAGTATGA-3′；NRF2反向引物，5′-CCACTGGTTTCTGACTGGATGT-3′；β-actin正向引物，5′-ATGATGATATCGCCGCGCTC-3′；β-actin反向引物，5′-TCGATGGGGTACTTCAGGG-3′。

1.4 細胞分組與轉染 實驗分為Con組(不做轉染)、NC組(轉染陰性對照)、NRF2 siRNA-1組(轉染NRF2 siRNA-1)、NRF2 siRNA-2組(轉染NRF2 siRNA-2)和NRF2 siRNA-3組(轉染NRF2 siRNA-3)。將長勢良好的對數(shù)生長期PC-3細胞以每孔1.5×106個細胞接種于6孔細胞板上，在細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)過夜，待細胞生長至貼壁75%左右時，按照實驗分組，參照轉染試劑脂質體2000的說明書步驟將NRF2干擾序列和陰性對照序列轉染至PC-3細胞中。待轉染48 h后，收集各組細胞，采用Western blot和RT-PCR檢測轉染結果。其中NRF2的3條干擾序列NRF2 siRNA-1(5′-CCAACCAGUUGACAGUGAACUCAUU-3′)、NRF2 siRNA-2(5′-CAAUGAAGCUCAACUUGCAUUAAUU-3′)、NRF2 siRNA-3(5′-CAAACUGACAGAA-GUUGACAAUUAU-3′)及陰性對照序列(5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′)由海吉凱生物公司合成。

1.5 CCK-8實驗 將對數(shù)生長期的Con組、NC組和NRF2 siRNA組(即轉染NRF2 siRNA-3序列的細胞)細胞以每孔104個接種至96孔細胞板上，每組實驗設置3個重復。于細胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72 h，取出培養(yǎng)板。每孔加入CCK-8試劑10 μl，孵育2 h后，上酶標儀于490 nm波長處檢測各組的吸光度(OD值)，并按照細胞存活率(%)=100%×(OD實驗組-OD空白組)/(OD對照組-OD空白組)的公式計算各組細胞的存活率。

1.6 平板克隆實驗 將對數(shù)生長期的Con組、NC組和NRF2 siRNA組細胞以每孔600個接種至6孔細胞板上，于細胞培養(yǎng)箱內常規(guī)培養(yǎng)14 d，定期觀察。當有肉眼可見的細胞集落形成時，停止培養(yǎng)。去上清，以磷酸緩沖液洗滌細胞后，分別以10%甲醇固定30 min和0.1%結晶紫染色15 min。洗去染色液并晾干。采用顯微鏡隨機選取5個視野觀察計數(shù)，以大于50個細胞的集落作為有效克隆。根據(jù)公式克隆形成率(%)=100%×(克隆細胞數(shù)/接種細胞數(shù))計算各組細胞的克隆形成能力。每組實驗重復3次。

1.7 Transwell實驗 取Transwell小室，采用濃度為8.4 g/L的Matrigel凝膠50 μl對孔徑為8 μm的聚碳酸酯微孔膜進行包被(侵襲實驗)或不做處理(遷移實驗)。將Con組、NC組和NRF2 siRNA組細胞以無血清的RPMI 1640培養(yǎng)液制成濃度為105個/ml的細胞懸液。取細胞懸液100 μl加入小室上室中，并向下室中加入含胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液600 μl。于細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h后，取出小室，小心擦去微孔濾膜上的細胞，采用4%多聚甲醛對下室內的細胞固定30 min，0.1%結晶紫染色15 min。顯微鏡下觀察。各組細胞的侵襲和遷移能力以隨機選取5個視野的穿膜細胞數(shù)的均值表示。

1.8 Western blot實驗 采用RIPA細胞裂解液提取待測的各組PC-3細胞的總蛋白后，以BCA法對總蛋白的濃度進行定量。按照每孔50 μg蛋白樣品上樣至SDS-PAGE凝膠孔中進行電泳分離。待電泳結束后，轉膜。封閉液(含5%脫脂奶粉)常溫封閉PVDF膜2 h后，分別以1∶500倍稀釋的NRF2和N-cadherin抗體、1∶800倍稀釋的MMP-9、CyclinD1和Ki67抗體于4 ℃下孵育24 h，再以1∶2000倍稀釋的HRP標記的羊抗兔/鼠IgG二抗于常溫孵育2 h。經ECL顯影曝光后，以β-actin為內參，凝膠成像系統(tǒng)檢測分析目的蛋白的相對表達量。每組實驗重復3次。

2 結 果

2.1 NRF2 siRNA下調前列腺癌PC-3細胞中NRF2的表達 RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，人前列腺上皮細胞株RWPE-1和前列腺癌細胞株PC-3中NRF2 mRNA的相對表達量分別為0.22±0.03和0.84±0.05。與RWPE-1細胞相比，PC-3細胞中NRF2 mRNA的表達水平明顯升高(P<0.05)。PC-3細胞轉染NRF2 siRNA后，經Western blot和RT-PCR檢測，與Con組相比，NC組細胞中NRF2蛋白和mRNA的表達水平無顯著差異(P>0.05)，而NRF2 siRNA-1組、NRF2 siRNA-2組和NRF2 siRNA-3組細胞中NRF2蛋白和mRNA的表達均明顯降低，且NRF2 siRNA-3組降低幅度明顯大于NRF2 siRNA-1和NRF2 siRNA-2組(P<0.05，圖1、表1)。故后續(xù)選用NRF2 siRNA-3干擾序列進行實驗。

圖1 Western blot檢測各組細胞中NRF2蛋白的表達

組別蛋白mRNACon組0.76±0.071.00±0.05NC組0.68±0.060.96±0.06NRF2siRNA-1組0.56±0.04①0.80±0.05①NRF2siRNA-2組0.39±0.03①0.52±0.03①NRF2siRNA-3組0.11±0.02①②0.26±0.03①②F88.092141.808P0.0000.000

注：與Con組相比，①P<0.05；與NRF2siRNA-1組和NRF2 siRNA-2組相比，②P<0.05

2.2 NRF2基因沉默抑制前列腺癌PC-3細胞的增殖 CCK-8法檢測結果顯示，轉染24、48、72 h，NC組細胞的存活率與Con組相比無統(tǒng)計學差異，而NRF2 siRNA組的細胞存活率在各時間點較Con組均明顯降低(P<0.05)。同時，平板克隆實驗結果顯示，與Con組相比，NC組細胞的克隆形成率差異無統(tǒng)計學意義，但NRF2siRNA組明顯降低(P<0.05，表2)。

組別細胞存活率(%)24h48h72h克隆形成率(%)Con組99.86±5.0597.28±6.3694.57±5.4966.52±4.85NC組97.13±6.3295.35±5.2292.06±4.8461.76±5.12NRF2siRNA組82.05±5.24①64.57±4.85①45.62±3.76①39.35±3.26①F8.91433.234101.00931.386P0.0160.0010.0000.001

注：與Con組相比，①P<0.05

2.3 NRF2基因沉默抑制前列腺癌PC-3細胞的侵襲和遷移 Transwell小室實驗檢測結果顯示，NC組的侵襲細胞數(shù)和遷移細胞數(shù)與Con組相比差異無統(tǒng)計學意義，而NRF2siRNA組較Con組均顯著降低(P<0.05，表3)。

組別侵襲細胞數(shù)(個)遷移細胞數(shù)(個)Con組85.00±7.50118.50±8.00NC組78.50±5.00109.00±6.50NRF2siRNA組42.00±5.50①58.00±3.00①F43.36682.666P0.0000.000

注：與Con組相比，①P<0.05

2.4 NRF2基因沉默抑制前列腺癌PC-3細胞中Ki67、CyclinD1、MMP-9和N-cadherin蛋白的表達 Western blot檢測結果顯示，與Con組相比，NRF2 siRNA組細胞中Ki67、CyclinD1、MMP-9和N-cadherin蛋白的表達水平均明顯降低(P<0.05)，而NC組與Con組間這四種蛋白的表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖2、表4)。

圖2 Western blot檢測Ki67、CyclinD1、MMP-9

組別Ki67CyclinD1MMP-9N-cadherinCon組0.78±0.050.85±0.060.89±0.070.49±0.04NC組0.83±0.060.82±0.050.92±0.060.53±0.05NRF2siRNA組0.25±0.03①0.41±0.03①0.10±0.02①0.22±0.02①F132.81477.700218.66356.967P0.0000.0000.0000.000

注：與Con組相比，①P<0.05

3 討 論

前列腺癌是一種男性泌尿生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率高居美國男性惡性腫瘤的首位[8]，并且在我國的發(fā)病率有逐漸升高的趨勢[9，10]。目前，關于前列腺癌的治療多以手術、放化療為主，但存在一定的局限性。前列腺癌的發(fā)生發(fā)展機制尚不明確，與癌基因、抑癌基因和信號通路調控等多種因素相關，腫瘤細胞的惡性增殖是前列腺癌發(fā)生的重要因素，而腫瘤細胞的侵襲、遷移能力與腫瘤發(fā)生局部浸潤和遠處轉移關系密切[11]。因此，研究前列腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移的分子機制對改善和治療前列腺癌具有重要意義。

NRF2是CNC亮氨酸拉鏈轉錄激活因子家族成員，可通過調控HO-1、GST和SOD等發(fā)揮抗氧化的細胞保護作用；然而，其過渡積累又可增強腫瘤細胞對放化療的抗性，與Ki67、Myc和K-Ras等多種致癌基因有關，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉移過程中發(fā)揮著重要作用[12]。NRF2異常高表達與食管癌患者有無復發(fā)和總生存率有關，NRF2siRNA可通過調節(jié)谷胱甘肽代謝和ROS抑制癌細胞生長、誘導G1期細胞周期阻滯和凋亡；還可通過下調HO-1、Bcl-2及MMP-9蛋白表達參與調控腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲轉移及放療敏感性[13-14]。NRF2 mRNA水平的升高預示乳腺癌患者預后不良，NRF2沉默可通過RhoA/ROCK信號轉導通路抑制MCF7和MDA-MB-231細胞的增殖、遷移和侵襲[15]。NRF2沉默或敲除可增強化療劑氟尿嘧啶(5-FU)對胰腺癌細胞的抗增殖作用，其作用機制可能與降低ALDH1A1和ALDH3A1的表達有關[16]。在膽管癌中，NRF2敲除抑制了腫瘤細胞的集落形成，增強了5-氟尿嘧啶抗增殖活性，通過下調Cyclin D1和上調p21表達誘導細胞阻滯于G0/G1期[17]。可見，NRF2可通過多種途徑參與腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移等生物學過程，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關系密切。

本研究證實了NRF2在前列腺癌PC-3細胞中異常高表達。通過轉染NRF2干擾序列成功下調NRF2表達后，發(fā)現(xiàn)PC-3細胞的增殖、克隆形成、侵襲和遷移能力均明顯減弱。這說明，前列腺癌中異常高表達的NRF2能夠促進癌細胞的增殖和轉移，進而促進前列腺癌的發(fā)生發(fā)展。Ki67常被作為判斷腫瘤細胞增殖重要指標，Cyclin D1是推動細胞從G1期進入S期的特異性周期蛋白，MMP-9是基質金屬蛋白酶家族中的一種明膠酶，在維持細胞外基質的降解和重塑過程中發(fā)揮著重要作用，N-cadherin是一種細胞黏附因子，在介導細胞間的黏附和遷移過程中發(fā)揮著重要作用，四者均在前列腺癌組織中均異常高表達，與腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移過程密切相關[18，19]。為了探討NRF2調控前列腺癌細胞增殖和轉移的分子機制，本研究在NRF2基因沉默后檢測發(fā)現(xiàn)，PC-3細胞中Ki67、CyclinD1、MMP-9和N-cadherin蛋白的表達水平均明顯受到抑制。結果提示，NRF2基因沉默可能通過抑制CyclinD1和Ki67蛋白表達抑制腫瘤細胞增殖，通過抑制MMP-9和N-cadherin蛋白表達抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移。

總之，NRF2高表達在前列腺癌細胞增殖、侵襲和轉移過程中發(fā)揮著重要的促進作用，其作用機制可能與調控Ki67、CyclinD1、MMP-9和N-cadherin蛋白的表達有關。沉默NRF2基因表達，抑制腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移可能是改善和治療前列腺癌的一種新途徑。