靳楓 余少康 王樹濱

【摘要】 目的：檢測(cè)胃癌組織中miR-424的表達(dá)，并探討其與胃癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。方法：選取本院收治的55例胃癌患者的胃癌組織樣本及相應(yīng)癌旁組織，應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)胃癌組織和癌旁組織中miR-424 mRNA表達(dá)，分析其與胃癌臨床病理特征間的關(guān)系。結(jié)果：4例患者隨訪失敗，研究實(shí)際完成51例;胃癌組織中miR-424 mRNA陽性檢出率為66.67%，明顯高于癌旁組織的23.53%（P<0.01）;胃癌組織中miR-424 mRNA的表達(dá)高于癌旁組織（P<0.01）;胃癌組織中miR-424 mRNA的表達(dá)與胃癌患者的年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤直徑無關(guān)（P>0.05），與浸潤深度、TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0.01）;1年期隨訪發(fā)現(xiàn)，死亡15例，存活36例;死亡組在入院時(shí)胃癌組織中miR-424 mRNA表達(dá)高于存活組（P<0.01）。結(jié)論：miR-424 mRNA在胃癌組織中高表達(dá)，與胃癌的臨床病理特征密切相關(guān)，可能是評(píng)判胃癌患者預(yù)后的有效指標(biāo)。

【關(guān)鍵詞】 miR-424; 胃癌; 臨床病理特征

【Abstract】 Objective：To observe miR-424 expression of gastric cancer tissue，and investigate the relationship between miR-424 and clinicopathological parameters of gastric cancer and prognosis.Method：A total of gastric cancer tissue samples and corresponding adjacent tissues from 55 patients with gastric cancer in our hospital were selected.The expression of miR-424 in gastric cancer tissues and adjacent tissues was detected by RT-PCR，and the relationship between miR-424 and clinicopathological features of gastric cancer was analyzed.Result：4 patients failed in follow-up，and 51 patients actually completed the study.The positive rate of miR-424 in gastric cancer tissues was 66.67%，which was significantly higher than 23.53% in adjacent tissues（P<0.01）.The expression of miR-424 in gastric cancer tissues was higher than that of adjacent tissues（P<0.01）.The expression of miR-424 in gastric cancer tissues was not related to age，sex，location of tumors and diameter of tumors（P>0.05），but to depth of invasion，TNM stage，differentiation degree and lymph node metastasis（P<0.01）.One-year follow-up showed that 15 patients died and 36 survived，and the expression of miR-424 in gastric cancer tissues of the death group was higher than that of the survival group at admission（P<0.01）.Conclusion：Expression of miR-424 mRNA of gastric cancer tissues is high，closely related to clinicopathological parameters of gastric cancer，and may be the effective index for evaluating the prognosis.

【Key words】 miR-424; Gastric cancer; Clinicopathological features

First-authors address：Peking University Shenzhen Hospital，Shenzhen 518000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.07.032

胃癌是一種最常見惡性腫瘤，患者的預(yù)后差，其致死率位居整個(gè)惡性腫瘤的第3位，對(duì)人類的健康、生存構(gòu)成了嚴(yán)重威脅[1]。據(jù)報(bào)道早期胃癌的5年期生存率超過90%，但在進(jìn)展期胃癌的5年生存率僅有5%～20%[2]，臨床資料顯示絕大多數(shù)胃癌患者在確診時(shí)已屬中晚期，失去了手術(shù)的時(shí)機(jī)，同時(shí)存在放化療效的效果欠佳及不良反應(yīng)重等[3]。消化道造影、胃鏡是診斷胃癌的金標(biāo)準(zhǔn)，但有操作較為復(fù)雜、患者耐受差以及價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)[3]。腫瘤標(biāo)志物是早期確診胃癌的有效指標(biāo)，有操作便捷、創(chuàng)傷小、結(jié)果及時(shí)可靠等優(yōu)點(diǎn)，但目前胃癌腫瘤標(biāo)志物特異性及敏感性較差[4]。miR-424是miR-16家族成員，其基因位于染色體Xq26.3上，Xq26區(qū)域與多種腫瘤的形成、發(fā)展密切相關(guān)。研究表明，miR-424在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、預(yù)后中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，而且在非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、腎癌等多種腫瘤中均有表達(dá)。然而miR-424在胃癌組織中表達(dá)的相關(guān)研究目前國內(nèi)外尚鮮見報(bào)道。本研究通過逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）方法，檢測(cè)miR-424 mRNA在胃癌組織中的表達(dá)情況，并探討其和胃癌臨床病理學(xué)參數(shù)及患者預(yù)后的關(guān)系。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年2月-2017年2月本院收治的55例胃癌患者的胃癌組織樣本，均經(jīng)病理證實(shí)為胃癌，術(shù)前均未接受放療、化療等輔助治療，且有完整臨床病理資料;同時(shí)取對(duì)應(yīng)癌旁組織（距癌組織邊緣≥5 cm）為對(duì)照組，均經(jīng)病理證實(shí)為正常胃組織。本研究得到本醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

1.2 方法

1.2.1 試劑與設(shè)備 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒購由美國Sigma公司提供;TRIzol試劑購由碧云天生物技術(shù)研究所提供;miR-424、β-Actin引物購于上海生工生物工程有限公司。

1.2.2 RT-PCR檢測(cè)胃癌及癌旁組織中miR-424 mRNA表達(dá) 具體檢測(cè)方法：將冷凍的胃癌組織及癌旁周圍正常組織勻漿，Trizol法提取胃癌及癌旁組織中總RNA，向RNA沉淀中加入焦炭酸二乙酯，靜置于冰上30 min，置于-80 ℃保存;測(cè)定樣品中RNA的純度、濃度，取適量RNA反應(yīng)物行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA（反轉(zhuǎn)錄程序：30 ℃反應(yīng)10 min，42～60 ℃反應(yīng)30 min，85℃和5 ℃分別反應(yīng)5 min），采取SYBP Green premix Ex taq試劑盒檢測(cè)胃癌和癌旁組織中miR-424 mRNA表達(dá);PCR引物為miR-424上游引物：5-gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactgg-3，下游引物：5-cgaacgagcagcaattcatg-3;β-Actin為內(nèi)參照，上游引物：5-gcgagaagatgacccaccacc-3，下游引物：5-atgtcacgcacgatttcctatta-3;PCR反應(yīng)體系：95 ℃預(yù)變性5 min，再行38個(gè)循環(huán)（94 ℃變性30 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s），72 ℃延伸反應(yīng)5 min。每個(gè)組織標(biāo)本重復(fù)擴(kuò)增3次，PCR電泳結(jié)果采用凝膠圖像掃描系統(tǒng)檢測(cè)各電泳條帶的吸光度值，計(jì)算miR-424 mRNA產(chǎn)物量與內(nèi)參β-actin mRNA產(chǎn)物量比值即為本研究結(jié)果。

1.3 觀察指標(biāo) （1）比較胃癌組織和癌旁組織中miR-424 mRNA陽性率。（2）比較胃癌組織和癌旁組織中miR-424 mRNA表達(dá)。（3）分析胃癌組織中miR-424 mRNA表達(dá)與患者的臨床病理特征的關(guān)系。（4）對(duì)患者進(jìn)行1年期隨訪，記錄死亡病例，比較存活患者（存在組）和死亡患者（死亡組）入院時(shí)胃癌組織中miR-424 mRNA表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 18.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌病例篩選情況 4例患者隨訪失敗，研究實(shí)際完成51例，其中男34例，女17例;年齡52～70歲，平均（65.03±7.40）歲，≥60歲者30例，<60歲者21例;分化程度：低分化33例，中分化11例，高分化7例;部位：賁門5例，胃體18例，幽門28例;原發(fā)腫瘤最大直徑：≤5 cm者19例，>5 cm者32例;TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期23例，Ⅲ～Ⅳ期28例;腫瘤浸潤深度：未侵及漿膜者26例，侵及漿膜者25例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：無區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移15例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36例。

2.2 胃癌組織和癌旁組織中miR-424 mRNA檢出情況 胃癌組織中miR-424 mRNA陽性檢出率為66.67%（34/51），明顯高于癌旁組織的23.53%（12/51），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=17.462，P<0.01）。

2.3 胃癌組織和癌旁組織中miR-424 mRNA表達(dá)比較 胃癌組織中miR-424 mRNA的表達(dá)為（0.721±0.079），高于癌旁組織的（0.311±0.034），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.260，P<0.01）。

2.4 胃癌組織中miR-424 mRNA表達(dá)與胃癌病理特征的關(guān)系 胃癌組織中miR-424 mRNA的表達(dá)與胃癌患者的年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤直徑無關(guān)（P>0.05），與浸潤深度、TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0.01），見表1。

2.5 死亡組和存活組miR-424 mRNA表達(dá)比較 1年期隨訪發(fā)現(xiàn)，死亡15例，存活36例;死亡組在入院時(shí)胃癌組織中miR-424 mRNA表達(dá)為（0.833±0.103），高于存活組的（0.609±0.07），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.170，P<0.01）。

3 討論

我國是胃癌的高發(fā)區(qū)，其發(fā)病率和死亡率均高居整個(gè)惡性腫瘤的前列。目前對(duì)胃癌形成、發(fā)展的認(rèn)知不斷深入，如大量腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)有助于臨床診斷胃癌，但現(xiàn)有胃癌標(biāo)志物的敏感性和特異性較差，探索新的胃癌標(biāo)志物仍是提高胃癌確診的重要醫(yī)學(xué)問題[4-6]。胃癌的發(fā)生機(jī)制尚未闡明，癌基因和抑癌基因的改變是其重要調(diào)控機(jī)制，機(jī)體內(nèi)這些基因的改變對(duì)胃癌的生物學(xué)行為及其預(yù)后有重要影響[7-8]。miR-16家族主要包括miR-15a/b、miR-16、miR-195、miR-424等成員，參與細(xì)胞存活、增殖及凋亡等過程，其中miR-424基因位于染色體Xq26.3，具體位置為10：133680644-133680741，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、治療預(yù)后聯(lián)系密切[9]。文獻(xiàn)[10]報(bào)道m(xù)iR-424與一些惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)，且對(duì)不同腫瘤其侵襲轉(zhuǎn)移的作用有所差異，即促進(jìn)或抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

miR-424在不同癌細(xì)胞中的作用機(jī)制不盡相同。在宮頸癌細(xì)胞中，miR-424的低表達(dá)可降低基質(zhì)金屬蛋白酶9活性，從而抑制細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移[11-12];同時(shí)宮頸癌中miR-424低表達(dá)，也可促進(jìn)靶基因細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)激酶1的表達(dá)，引起細(xì)胞周期G1/S受阻，關(guān)閉細(xì)胞分裂周期，導(dǎo)致細(xì)胞增殖停滯[11-12]。SOCS6有負(fù)性調(diào)控細(xì)胞因子信號(hào)通路效應(yīng)，抑制miR-424表達(dá)可上調(diào)靶基因SOCS6表達(dá)，同時(shí)抑制下游ERK信號(hào)通路，促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移[13]。在結(jié)腸癌中，miR-424可激活mTORC2信號(hào)通路，該信號(hào)通路具有調(diào)控細(xì)胞生長的作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長[14]。腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移與血管新生密切相關(guān)，當(dāng)原位瘤體積超過1 mm3，需刺激血管生成及通過血管通道代謝途徑，以促進(jìn)腫瘤生長[5]。研究發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌患者中miR-424的表達(dá)異常，且與組織血管的增生明顯相關(guān)，miR-424過表達(dá)通過促進(jìn)血管增生，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移[15]。提示miR-424可能是胃癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移的有效分子標(biāo)志。

本研究應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)顯示，胃癌組織中miR-424 mRNA陽性檢出率為66.67%，明顯高于癌旁組織的23.53%（P<0.01）;胃癌組織中miR-424 mRNA的表達(dá)高于癌旁組織（P<0.01）;胃癌組織中miR-424 mRNA的表達(dá)與胃癌患者的年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤直徑無關(guān)（P>0.05），與浸潤深度、TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0.01）;1年期隨訪發(fā)現(xiàn)，死亡15例，存活36例;死亡組在入院時(shí)胃癌組織中miR-424 mRNA表達(dá)高于存活組（P<0.01）。上述結(jié)果從基因轉(zhuǎn)錄水平說明了miR-424表達(dá)可能是臨床評(píng)價(jià)胃癌臨床病理特征及患者治療預(yù)后的有效指標(biāo)。

綜上所述，miR-424 mRNA在胃癌組織中高表達(dá)，與胃癌的分化程度等臨床病理特征密切相關(guān)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)miR-424的過度表達(dá)與患者的預(yù)后相關(guān)，因此，檢測(cè)胃癌組織中miR-424 mRNA的表達(dá)有助于胃癌的診斷及預(yù)后判斷，但目前miR-424對(duì)胃癌的作用機(jī)制研究較少，利用miR-424將為臨床胃癌發(fā)生發(fā)展的確診、預(yù)后評(píng)判以及藥物篩選提供新策略。

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（收稿日期：2018-07-26） （本文編輯：董悅）