孫長(zhǎng)河,賀康洪，趙 昕*

0 引言

原解放軍第406醫(yī)院配制的非標(biāo)準(zhǔn)制劑烏甘膠囊，由海螵蛸[1]、甘草[2]等藥味組成，有收斂止血、制酸止痛、解痙斂瘡的功效，主要用于胃潰瘍、十二指腸球部潰瘍及慢性胃炎等癥的治療，臨床療效良好。為保證臨床用藥有效、安全，本研究對(duì)烏甘膠囊的主要成分進(jìn)行了定性定量方法研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

日本島津LC-2010AHT高效液相色譜儀(紫外檢測(cè)器)；KQ3200E型昆山超聲波處理器。甘草對(duì)照藥材(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：121272-201404)，甘草苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，供含量測(cè)定用，含量93.7%，批號(hào)：111610-201106)；樣品：烏甘膠囊(規(guī)格：0.43 g/粒，原中國(guó)人民解放軍第406醫(yī)院配制，批號(hào)：140912、140913、140915)；試劑：乙腈(色譜純，Tedia公司)，自制純化水；其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別 顯微鏡下應(yīng)可見(jiàn)不規(guī)則透明薄片或碎塊，具細(xì)條紋或網(wǎng)狀紋理(海螵蛸)。纖維束周?chē)”诩?xì)胞含草酸鈣方晶，形成晶纖維。具緣紋孔導(dǎo)管較大，稀有網(wǎng)紋導(dǎo)管；木栓細(xì)胞紅棕色，多角形(甘草)。如圖1。

2.2 甘草的薄層色譜鑒別[3]取烏甘膠囊內(nèi)容物2 g,加稀鹽酸3 ml，三氯甲烷15 ml，加熱回流1 h，放冷，濾過(guò)，蒸干，殘?jiān)右掖?.5 ml，溶解，作為供試品溶液。取甘草對(duì)照藥材1 g，加稀鹽酸3 ml，三氯甲烷15 ml，加熱回流1 h，放冷，濾過(guò)，蒸干，殘?jiān)右掖?.5 ml，溶解，作為對(duì)照藥材溶液。再按烏甘膠囊處方工藝，除甘草外各味藥材制成膠囊，取內(nèi)容物，按供試品溶液方法操作，制得陰性樣品溶液。取上述3種溶液各5 μl，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以石油醚(30～60 ℃)-甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸 (10∶20∶7∶0.6)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%磷鉬酸乙醇試液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。陰性溶液無(wú)干擾。見(jiàn)圖2。

圖2 烏甘膠囊TLC鑒別圖

2.3 烏甘膠囊中甘草苷含量測(cè)定[4-5]

2.3.1 對(duì)照品、供試品及陰性樣品溶液的制備 ①甘草苷對(duì)照品溶液的制備：取甘草苷對(duì)照品10 mg，精密稱定，至50 ml容量瓶中，加70%乙醇溶解并稀釋至刻度，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液10 ml，至100 ml容量瓶中，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得1 ml含20 μg的對(duì)照品溶液。②供試品溶液的制備：精密稱取烏苷膠囊內(nèi)容物0.25 g，置25 ml容量瓶中，精密加入70%乙醇25 ml，密閉，稱重。超聲處理30 min，放冷，稱重，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，取上清液薄膜濾過(guò)，即得。③陰性樣品溶液的制備：取除甘草外的其他藥材，按烏甘膠囊處方比例及制劑工藝制成膠囊劑，按上述供試品溶液制備方法操作，制成陰性樣品溶液。

2.3.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性 色譜柱：WondaSil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以乙腈為流動(dòng)相A，以0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相B，按表1梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為 276 nm；流速1.0 ml/min；柱溫25 ℃。理論板數(shù)按甘草苷峰計(jì)算不低于2 000。分別取上述3種溶液各10 μl進(jìn)樣，結(jié)果表明，樣品中待測(cè)成分分離良好，陰性對(duì)照無(wú)干擾，見(jiàn)圖3。

表1 甘草苷測(cè)定梯度洗脫表

2.3.3 甘草苷對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱取甘草苷對(duì)照品適量，加70%乙醇制成每1 ml含20.614 0 μg的溶液，分別精密吸取該對(duì)照品溶液2l、6l、10l、14l、18l、22 μl，分別注入液相色譜儀，測(cè)定。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)作圖，得一條直線?；貧w方程為y = 2×106x+52.038，r=1。結(jié)果表明，甘草苷進(jìn)樣量在0.041 23～0.453 51 μg范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3.4 進(jìn)樣精密度考察 取同一對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，則RSD為0.33% (n=6)，符合要求。

2.3.5 中間精密度試驗(yàn) 在同一實(shí)驗(yàn)室，兩人于不同時(shí)間分別用Agilent TC-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱與島津WondaSil C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱進(jìn)行試驗(yàn)，按“2.3.1”項(xiàng)下供試品溶液制備方法操作，各制備6份供試品溶液，進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明，中間精密度良好，RSD=1.71%(n=6)。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液(按“2.3.1”項(xiàng)下供試品溶液制備方法操作制備)，分別于0、4、8、12、16、24 h進(jìn)樣10 μl，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，RSD為0.61%，結(jié)果表明，樣品溶液至少在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號(hào)為140915烏甘膠囊內(nèi)容物適量，6份，精密量取，按“2.3.1”項(xiàng)下供試品溶液制備方法操作，制備供試品溶液；另精密稱取甘草苷對(duì)照品適量，2份，按“2.3.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液制備方法操作，制備對(duì)照品溶液。測(cè)定甘草苷的含量，結(jié)果顯示，RSD為0.71%(n=6)，符合要求。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取烏甘膠囊(批號(hào)：140915，甘草苷含量為2.152 1 mg/g)0.20、0.25、0.30 g 3個(gè)梯度樣品，每個(gè)梯度3份，分別加入50 ml容量瓶中；稱取對(duì)照品溶液制備項(xiàng)下的對(duì)照品儲(chǔ)備液(含量：93.7%，10.56 mg)25 ml，置100 ml容量瓶中，70%乙醇定容至刻度，搖勻，分別取8.0、10.0、12.0 ml對(duì)照品溶液加入上述已稱取烏甘膠囊的3個(gè)梯度容量瓶中，再分別在3個(gè)梯度量瓶中加70%乙醇92、90、88 ml，密閉，稱重。超聲處理30 min，放冷，稱重，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，即得，進(jìn)樣，測(cè)定甘草苷的含量，計(jì)算回收率，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3.9 檢驗(yàn)3批烏甘膠囊 按本品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)“2.3.1”項(xiàng)下供試品溶液制備方法操作，制備供試品溶液，測(cè)定3批烏甘膠囊中甘草苷的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，烏甘膠囊各批次甘草苷的含量基本穩(wěn)定。

3 討論

3.1 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，筆者對(duì)流動(dòng)相乙腈-0.1%磷酸溶液(15∶85)、乙腈-0.1%磷酸溶液(28∶72)、70%乙醇-0.1%磷酸溶液(45∶55)進(jìn)行了考察，結(jié)果乙腈-0.1%磷酸溶液(28∶72)為流動(dòng)相時(shí)，甘草苷峰與其他成分峰分離度>1.5，峰形好，對(duì)稱因子符合規(guī)定。取樣品溶液進(jìn)樣10 μl，采集數(shù)據(jù)120 min，在70 min后仍有色譜峰出現(xiàn)，故采取梯度洗脫分析方法。

圖3 烏甘膠囊HPLC圖

序號(hào)取樣量(g)峰面積(平均值)實(shí)測(cè)值(mg)樣品中甘草苷含量(mg)對(duì)照品加入量(mg)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)10.201 73325 1500.823 70.434 10.395 898.4320.200 01322 6420.817 40.430 40.395 897.7630.199 89322 492.50.817 00.430 20.395 897.7340.252 27401 6741.017 60.542 90.494 795.9550.251 83407 8231.033 20.542 00.494 799.2998.611.5160.259 55415 8201.053 40.558 60.494 7100.0270.299 86483 5821.225 10.645 30.593 797.6680.303 17492 083.51.246 60.652 50.593 7100.0890.305 18494 8121.253 50.656 80.593 7100.52

表3 烏甘膠囊中甘草苷的含量測(cè)定結(jié)果

注：*為平均值

3.2 制備樣品溶液時(shí)，為了保證測(cè)定準(zhǔn)確性，在實(shí)驗(yàn)中分別對(duì)甘草苷的提取方式、使用的提取溶劑、加入溶劑量、每次提取的時(shí)間以及提取的次數(shù)進(jìn)行了考察。其中考察提取方式時(shí)，分別采用超聲與熱回流2種方式，結(jié)果表明，采用超聲和加熱提取方法時(shí)，二者所測(cè)得的甘草苷含量相當(dāng)，但超聲提取方法的操作簡(jiǎn)便；考察提取溶劑時(shí)，分別使用了50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇，結(jié)果表明，70%乙醇提取率高，故選取70%乙醇作為提取溶劑。